Преузето са www.pravno-informacioni-sistem.rs

Редакцијски пречишћен текст

На основу члана 24. став 4. Закона о вину („Службени гласник РС”, бр. 41/09 и 93/12),

Министар пољопривреде и заштите животне средине доноси

ПРАВИЛНИК

о параметрима и методама за анализу и утврђивање квалитета шире, вина и других производа од грожђа, шире, кљука и вина који се користе у производњи вина

"Службени гласник РС", бр. 107 од 8. октобра 2014, 72 од 31. августа 2023.

Члан 1.

Овим правилником се ближе прописују параметри и методе за анализу и утврђивање квалитета шире, вина и других производа од грожђа, шире, кљука и вина који се користе у производњи вина (у даљем тексту: други производи).

Члан 2.

Квалитет шире, вина и других производа утврђује се на основу вредности следећих параметара:

1) густине и релативне густине на 20°C;

2) алкохолне јачине;

3) садржаја укупног сувог екстракта;

4) садржаја редукујућих шећера;

5) садржаја пепела;

6) pH вредности;

7) садржаја укупних киселина;

8) садржаја испарљивих киселина;

9) садржаја неиспарљивих киселина;

10) садржаја слободног и укупног сумпор диоксида;

11) садржаја лимунске киселине;

12) садржаја угљен диоксида;

13) садржаја шећера одређеног рефрактометром;

14) релативног односа неизменљивих атома деутеријума и водоника у етанолу применом инструменталне технике TC/EA – IRMS;

15) дистрибуцијe деутеријума у етанолу добијеном ферментацијом грожђане шире, концентроване грожђане шире, грожђаног шећера (ректификоване грожђане шире) и вина применом нуклеарне магнетне резонанције (SNIF-NMR/RMN-FINS);

16) садржаја сахарозе;

17) садржаја глукозе и фруктозе;

18) алкалитета пепела;

19) релативног односа стабилних изотопа угљеника (13C/12C) у винском етанолу или етанолу добијеном ферментацијом грожђане шире, концентроване шире или грожђаног шећера применом масене спектрометрије за мерење изотопских односа (IRMS – Isotope Ratio Mass Spectrometry);

20) релативног односа стабилних изотопа кисеоника (18O/16O) у води вина и води шире применом изотопске масене спектрометрије (IRMS);

21) садржаја хлорида;

22) садржаја сулфата;

23) садржаја винске киселине;

24) садржаја млечне киселине;

25) садржаја L-јабучне киселине;

26) садржаја D-јабучне киселине;

27) садржаја укупне јабучне киселине;

28) садржаја сорбинске киселине;

29) садржаја L-аскорбинске киселине;

30) садржаја натријума;

31) садржаја калијума;

32) садржаја магнезијума;

33) садржаја калцијума;

34) садржаја гвожђа;

35) садржаја бакра;

36) садржаја кадмијума;

37) садржаја сребра;

38) садржаја цинка;

39) садржаја олова;

40) садржаја флуорида;

41) садржаја деривата цијанида;

42) хроматских особина;

43) Folin-Ciocalteu индекса;

44) садржаја диглукозид малвидола;

45) садржаја бромида;

46) садржаја бора;

47) садржаја укупног фосфора као P2O5;

48) садржаја глицерина;

49) садржаја вештачких боја;

50) садржаја арсена;

51) садржаја флуора;

52) садржаја метанола;

53) сензорних особина;

54) микробиолошких анализа.

Поред параметара из става 1. овог члана, квалитет других производа, и то: ректификоване концентроване шире који се утврђује специјалним и посебним методама утврђује се и на основу вредности следећих параметара:

1) алил изоцијаната;

2) садржаја укупних катјона;

3) проводљивости;

4) садржаја хидроксиметил фурфурала;

5) садржаја тешких метала;

6) хемијског одређивања етанола;

7) садржаја мезо-инозитола, сцило-инозитола и сахарозе.

Члан 3.

Методе за анализу и испитивање основних параметара квалитета шире, вина и других производа су одређивање:

1) густине и релативне густине на 20°C;

2) алкохолне јачине;

3) садржаја укупног сувог екстракта;

4) садржаја редукујућих шећера;

5) садржаја пепела;

6) pH вредности;

7) укупних киселина;

8) испарљивих киселина;

9) неиспарљивих киселина;

10) садржаја слободног и укупног сумпор диоксида;

11) лимунске киселине;

12) угљен диоксида;

13) садржаја шећера одређеног рефрактометром.

Методе из става 1. овог члана дате су у Прилогу 1. – Методе анализе којима се испитују основни параметри квалитета (у даљем тексту: Прилог 1), који је одштампан уз овај правилник и чини његов саставни део.

Члан 4.

Поред метода из члана 3. овог правилника, користе се и методе које су наведене у Табели 1 – Методе анализе за испитивање параметара квалитета шире, вина и других производа, као и друге методе које се спроводе по међународним стандардима прихваћеним од стране Републике Србије (резолуције OIV-a – Organisation Internationale de Vigne et du Vin) и стандардима и сродним документима признатих и донетих од стране националног тела за стандардизацију у Републици Србији.

Табела 1 – Методе анализе за испитивање параметара квалитета шире, вина и других производа

*Службени гласник РС, број 72/2023

Референтни документ означен једном звездицом (*) дат је у Прилогу 2. – Друге методе анализе, који је одштампан уз овај правилник и чини његов саставни део, а референтни документ означен са две звездице (**) дат је у Прилогу 3. – Специјалне и посебне методе анализе ректификоване концентроване шире, који је одштампан уз овај правилник и чини његов саставни део.

Члан 5.

Овај правилник ступа на снагу осмог дана од дана објављивања у „Службеном гласнику Републике Србије”, а примењује се од 1. јануара 2015. године.

Број 110-00-120/2014-09

У Београду, 26. септембра 2014. године

Министар,

проф. др Снежана Богосављевић Бошковић, с.р.

Прилог 1

МЕТОДЕ АНАЛИЗЕ КОЈИМА СЕ ИСПИТУЈУ ОСНОВНИ ПАРАМЕТРИ КВАЛИТЕТА

I. ОДРЕЂИВАЊЕ ГУСТИНЕ И РЕЛАТИВНЕ ГУСТИНЕ НА 20°C

Густина је маса вина или шире по јединици запремине на температури од 20°C. Изражена је у грамима по милилитру и означена симболом P20°C.

Релативна густина на 20°C/20°C (или специфична тежина при 20°C) је однос густине неке одређене запремине вина или шире на 20°C према густини исте запремине воде на истој температури и означава се симболом d 20/20.

Густина и релативна густина на 20°C мере се на експерименталном узорку коришћењем референтне методе (пикнометрија) или уобичајне методе (хидрометрија или дензиметрија употребом хидростатичке ваге). За врло прецизно мерење потребна је корекција густине због садржаја сумпор диоксида, а према формули:

ρ20°C = ρ‘20°C - 0,0006 × S

где је:

ρ20°C – коригована густина

ρ‘20°C – испитана густина

S – количина сумпор диоксида у грамима по литру.

Ако вино (или шира) садржи значајне количине угљен диоксида, спроводи се претходна припрема узорка тако што се главни део угљен диоксида уклони мућкањем 250 ml вина у боци од 1000 ml или филтрирањем под смањеним притиском кроз 2 g вате смештене у продуженој цевчици.

1.1. РЕФЕРЕНТНА МЕТОДА

а) Апаратура

Уобичајена лабораторијска опрема, а посебно:

– пикнометар од Пирекс стакла, запремине око 100 ml са одвојивим брушеним термометром, калибрисаним на десетинке степени од 10 до 30°C (слика 1: Пикнометар и његова тара посуда).

Слика 1: Пикнометар и његова тара посуда

Термометар мора бити стандардизован. Пикнометар има бочну цевчицу дужине 25 mm, унутрашњег пречника од 1 mm (максимално), која завршава конусним брушеним спојем. Ова бочна цевчица може се затворити затварачем који се састоји од цевчице са брушеним конусним спојем и завршава се резервоаром. Овај затварач служи као експанзиона комора. Ова два брушена споја треба припремати с великом пажњом;

– тара посуда која се састоји од пикнометра исте спољне запремине (разлика у запреминама може бити највише 1 ml) као пикнометар, а масом је једнака маси пикнометра испуњеног течношћу са специфичном тежином 1,01 (2,0 % (m/v) раствор натријум хлорида);

– термички изолована посуда која тачно одговара облику пикнометра;

– вага са два таса (twin-pan) с распоном од најмање 300 g и осетљивости од 0,1 mg или вага с једним тасом (single-pan) с распоном од најмање 200 g и осетљивости од 0,1 mg.

б) Калибрација пикнометра

Калибрација пикнометра укључује одређивање следећих вредности:

– масу празног пикнометра;

– запремину пикнометра на 20°C;

– масу пикнометра напуњеног водом на 20°C.

1) Методе за употребу ваге с два таса (twin-pan):

Поставити тара посуду на леви тас ваге, а чист и сув пикнометар, опремљен затварачем резервоара, на десни тас ваге. Додати тегове на тас на коме је пикнометар и забележити масу потребну да се успостави равнотежа: нека та маса буде p грама.

Пикнометар пажљиво напунити дестилованом водом на собној температури и убацити термометар. Пажљиво обрисати пикнометар и ставити га у термички изоловану посуду. Мешати окретањем посуде док температура очитана на термометру не постигне константну вредност. Поравнати ниво воде на врху бочне цевчице, брисањем је осушити и затворити затварачем. Пажљиво очитати температуру t°C, ако је потребно кориговати с обзиром на тачност скале термометра. Измерити водом напуњени пикнометар у односу на тара посуду и забележити масу p‘ у грамима потребну да се успостави равнотежа.

Израчунавање:

– Тарирање празног пикнометра:

маса празног пикнометра = p + m,

где је m маса ваздуха у пикнометру: m = 0,0012 (p - p').

– Запремина на 20°C:

V20°C = (p + m - p‘) x Ft

где је: Ft фактор (табела 1. овог прилога) за температуру t°C.

V20°C мора бити одређен са тачношћу од +/- 0,001 ml.

– Маса воде на 20°C:

M20°C = 0,998203 x V20°C

где је: 0,998203 густина воде на 20°C.

2) Методе за употребу ваге са једним тасом (single-pan)

Одредити:

– масу чистог и сувог пикнометра: P;

– масу пикнометра, напуњеног водом на t°C (као што је то описано у одељку 1.1. пододељак б) тачка 1) ове главе): P1;

– масу тара посуде: Т0.

Израчунавање:

– Тарирање празног пикнометра:

маса празног пикнометра = P - m,

где је m маса ваздуха у пикнометру: m = 0,0012 × (P1 - P).

– Запремина на 20°C:

V20°C = [(P1 – (P - m)] × Ft ,

где је Ft фактор (табела 1. овог прилога) за температуру t°C; запремина на 20°C мора бити одређена са тачношћу од +/- 0,001 ml.

– Маса воде на 20°C:

M20°C = 0,998203 x V20°C

где је 0,998203 густина воде на 20°C.

в) Методе мерења

1) Метода сa употребом ваге са два таса (twin-pan):

Напунити пикнометар са припремљеним узорком следећи поступак описан у одељку 1.1. пододељак б) тачка 1) ове главе.

Маса течности у пикнометру = p+ m - p''.

p‘‘ = маса (у грамима) потребна да се успостави равнотежа на температури од t°C.

Густина на температури t°C је:

ρt°c = (p + m – p'')/V20ºC

За израчунавање густине на 20°C користити табеле за корекцију температуре, у складу са врстом мереног узорка: за суво вино (табела 2. овог прилога), за природну или концентровану ширу (табела 3. овог прилога ), за слатко вино (табела 4. овог прилога).

Релативну густину вина или шире израчунавати:

d 20/20 = ρv / ρH2O = ρ20 / 0,998203

где је ρ20 густина вина на 20°C (коригована за слободни и укупни сумпор диоксид) у грамима по литру и 0,998203 је густина воде на 20°C у грамима по литру.

2) Метода са употребом ваге са једним тасом (single-pan)

Измерити тара посуду; масу означити са T1, израчунати: dТ = T1 – T0; маса празног пикнометра у време мерења = P - m + dT, измерити пикнометар напуњен припремљеним узорком као што је то описано у овој глави; његову масу на t°C означити са P2.

Маса течности у пикнометру на t°C = P2 - (P - m + dT ), густина на t°C:

ρt°c = P2 - (P – m + dT )/V20ºC

Израчунати густину испитиване течности на 20°C (суво вино, природна или концентрована шира, слатко вино) како је описано у одељку 1.1. пододељак в) тачка 1) ове главе.

Релативну густину узорка израчунати тако што његову густину на 20°C треба поделити са 0,998203.

3) Поновљивост мерења густине (r):

– за сува и полусува вина: r = 0,00010,

– за слатка вина: r = 0,00018.

4) Репродуктивност мерења густине (R):

– за сува и полусува вина: R = 0,00037,

– за слатка вина: R = 0,00045.

1.2. УОБИЧАЈЕНЕ МЕТОДЕ

1.2.1. ХИДРОМЕТРИЈА

а) Апаратура

– хидрометар:

Хидрометри својим димензијама и поделом скале морају одговарати ISO стандардима. Они морају имати цилиндричну куглу и цевчицу пречника најмање 3 mm. За сува вина морају имати скалу од 0,983 до 1,003 са поделом од 0,0010 и 0,0002. Свака ознака од 0,0010 мора бити раздвојена од следеће ознаке за најмање 5 mm. За мерење густине безалкохолних вина, слатких вина и шира мора се користити низ од пет хидрометара са скалом од 1,000 до 1,030; од 1,030 до 1,060; од 1,060 до 1,090; од 1,090 до 1,120; од 1,120 до 1,150. Ови хидрометри морају бити градуисани за густине на 20°C са поделом за најмање сваких 0,0010 и 0,0005, а свака ознака 0,0010 мора бити одвојена од следеће такве ознаке најмање 3 mm.

Хидрометри морају бити градуисани тако да се могу очитати „на врху менискуса”. Означавање густине или релативне густине на 20°C и очитавање „на врху менискуса” мора се вршити на градуисаној скали или на листу папира уметнутом у стаклену куглу. Калибрисање хидрометара мора вршити надлежан орган за мере и драгоцене метале;

– термометар који има скалу са минималном поделом од 0,5°C;

– мерни цилиндар с унутрашњим пречником од 36 mm и висином од 320 mm, који стоји усправно помоћу завртња за нивелацију.

б) Поступак

– Метода мерења:

Сипати 250 ml припремљеног узорка у мерни цилиндар (наведено у одељку 1.2.1. пододељак а) алинеја трећа ове главе) и у њега уронити термометар и хидрометар. Узорак добро промешати, сачекати један минут ради изједначавања температуре и потом очитати температуру. Извадити термометар и после још једног минута на скали хидрометра очитати густину на t°C.

Кориговати густину одређену при t°C на 20°C коришћењем припадајућих табела: за сува вина (табела 5. овог прилога), за ширу (табела 6. овог прилога), за слатка вина (табела 7. овог прилога).

Релативну густину вина или шире израчунати тако што се подели одређена густина припремљеног узорка на 20°C са 0,998203.

1.2.2. ДЕНЗИМЕТРИЈА УПОТРЕБОМ ХИДРОСТАТИЧКЕ ВАГЕ

а) Апаратура

– Хидростатичка вага са максималним капацитетом од најмање 100 g и осетљивости 0,1 mg;

– два идентична пловка од Пирекс-стакла, запремине од најмање 20 ml причвршћена испод сваког таса помоћу нити пречника не већег од 0,1 mm;

– пловак обешен под десним тасом мора бити такав да се може уметнути у мерни цилиндар који носи ознаку нивоа. Мерни цилиндар мора имати унутрашњи пречник најмање 6 mm шири од пречника пловка. Пловак мора бити такав да се може потпуно уронити у запремину мерног цилиндра испод ознаке. Урањање у површину течности која се мери сме се обавити само помоћу нити. Температура течности у мерном цилиндру мери се термометром са поделом скале од 0,2°C;

– може се користити и једнострана вага.

б) Поступак

– Калибрисање хидростатичке ваге:

Са оба пловка у ваздуху, успоставити равнотежу стављајући тегове на десни тас. Означити масу додатих тегова p. Напунити мерни цилиндар чистом водом до ознаке, промућкати и прочитати температуру t°C после два или три минута. Поново успоставити равнотежу стављајући тегове на десни тас: масу додатих тегова означити са p‘.

Запремина пловка на 20°C приказана је формулом:

V20°C = (p‘ - p) (F + 0,012);

где је:

F фактор за температуру t°C (табела 1. овог прилога), а p и V20°C су карактеристике пловка.

– Метода мерења:

Десни пловак уронити у одмерни цилиндар испуњен вином (или широм) до ознаке. Очитати температуру t°C вина (или шире) и масу тегова потребних да се успостави равнотежа и означити са p‘‘.

Густина ρt°C се добија из формуле:

ρtºC = [(p‘‚ - p)/V] + 0,0012

Ако је пловак од Пирекс-стакла ова се густина коригује на 20°C коришћењем табела 2, 3. или 4. овог прилога.

II. ОДРЕЂИВАЊЕ АЛКОХОЛНЕ ЈАЧИНЕ

Алкохолна јачина изражена запремином представља број литара етанола садржаног у 100 литара вина, при чему су обе запремине мерене на температури од 20°C, а изражава се симболом „% vol”.

Напомена: хомолози етанола, заједно са етанолом и хомолозима естара етанола, укључени су у алкохолну јачину, јер су присутни у дестилату.

Принципи метода:

2.1. Метода за добијање дестилата: дестилација вина којем је додата суспензија калцијум хидроксида. Мерење алкохолне јачине дестилата.

2.2. Референтна метода: мерење густине дестилата пикнометром.

2.3. Уобичајене методе:

2.3.1. мерење алкохолне јачине дестилата хидрометром,

2.3.2. мерење алкохолне јачине дестилата дензиметријски употребом хидростатичке ваге,

2.3.3. мерење алкохолне јачине дестилата рефрактометријски.

Напомена: за израчунавање алкохолне јачине из густине дестилата треба користити табеле 8, 9. и 10. овог прилога.

Табела 8. овог прилога садржи општу формулу која повезује алкохолну јачину изражену запремином и густину смеше алкохол-вода као функцију температуре.

2.1. МЕТОДА ЗА ДОБИЈАЊЕ ДЕСТИЛАТА

а) Апаратура

– Уређај за дестилацију који се састоји од: боце од 1 литра, са округлим дном и спојевима од брушеног стакла; колоне за ректификацију од око 20 cm висине или било ког сличног хладњака; извора топлоте (пиролиза екстракта мора се спречити одговарајућим поступком); хладњака који се завршава извученом цевчицом која води дестилат до дна одмерне тиквице која садржи неколико милилитара воде;

– апарат за дестилацију воденом паром који се састоји од: генератора паре; цеви за пару; колоне за ректификацију и хладњака.

Може се користити било који тип дестилације или дестилација воденом паром под условом да задовољава следећи тест:

Дестиловати смешу етанол-вода алкохолне јачине 10% vol пет пута за редом. Дестилат мора имати алкохолну јачину од најмање 9,9% vol после пете дестилације, тј. губитак алкохола за време сваке поједине дестилације не сме бити већи од 0,02% vol.

б) Реагенси

Суспензија калцијум хидроксида 2 М, која се добије тако што се пажљиво улије један литар воде температуре од 60°C до 70°C на 120 g живог (негашеног) креча (CaO).

в) Припрема узорка

Код младих и пенушавих вина уклонимо највећи део угљен диоксида мешајући 250 до 300 ml вина у тиквици од 500 ml.

г) Поступак

У одмерну тиквицу од 200 ml улити вино до црте и забележити температуру. Вино прелити у дестилациону тиквицу и ставити цев за пару. Одмерну тиквицу од 200 ml испрати четири пута сa по 5 ml воде и те запремине прелити у дестилациону тиквицу. Додати 10 ml калцијум хидроксида из одељка 2.1. пододељак б) ове главе и неколико куглица за кључање. Сакупљати дестилат у одмерну тиквицу од 200 ml раније употребљену за мерење запремине вина. Дестилисати до отприлике 3/4 почетне запремине ако се ради дестилацијом или запремине од 198 до 199 ml дестилата ако је примењена дестилација воденом паром. Допунити до 200 ml дестилованом водом, одржавајући дестилат на температури која се највише за 2°C разликује од почетне температуре. Мешати са великом пажњом кружним покретима.

Напомена: у случају вина која садрже велике концентрације амонијумових јона, дестилат се може дестиловати поново на начин описан у одељку 2.1. пододељак г) ове главе, али тако да се суспензија калцијум хидроксида замени са 1 ml разблажене сумпорне киселине 10:100.

2.2. РЕФЕРЕНТНА МЕТОДА

Алкохолну јачину дестилата мерити пикнометром.

а) Апаратура

– Користити пикнометар који је описан у глави I. одељак 1.1. пододељак а) алинеја прва овог прилога.

б) Поступак

Измерити густину дестилата (одељак 2.1. пододељак г) ове главе) на t°C како је описано у глави I. одељак 1.1. пододељак в) овог прилога. Ову густину означити као ρt°C.

в) Исказивање резултата

1) Израчунавање:

Одредити алкохолну јачину на 20°C коришћењем табеле 8. овог прилога. У водоравној колони ове табеле која одговара температури Т (израженој целим бројем) непосредно испод t°C, пронаћи најмању густину која је већа од ρt°C. Табеларну разлику испод ове густине употребити за прорачун густине ρ на температури Т.

У линији температуре Т наћи густину ρ непосредно изнад ρ‘ па израчунати разлику између густина ρ и ρ‘. Ову разлику делити са табеларном разликом која се налази десно од ρ‘. Коефицијент даје децимални део алкохолне јачине, док се њени цели бројеви налазе на врху колоне у којој се налази густина ρ‘.

Напомена: Ова корекција температуре инкорпорирана је у један компјутерски програм па постоји могућност да се изведе аутоматски.

2) Поновљивост, (r): r = 0,10% vol.

3) Репродуктивност, (R): R = 0,19% vol.

2.3. УОБИЧАЈЕНЕ МЕТОДЕ

2.3.1. ХИДРОМЕТРИЈА

а) Апаратура

– Алкохолометар,

– Термометар са поделом од 0,1°C, од 0°C до 40°C са тачношћу до 1/20 степени (0,05°C),

– Мерни цилиндар пречника 36 mm и висине 320 mm, који се држи усправно помоћу завртња за нивелацију.

б) Поступак

Дестилат (одељак 2.1. пододељак г) ове главе) се улије у мерни цилиндар. Цилиндар се држи усправно. Убаци се термометар и алкохолометар. Очита се температура на термометру након једноминутног мешања ради уравнотежења температуре у мерном цилиндру, термометра, алкохолометра и дестилата. Извуче се термометар и очита се јачина алкохола после једног минута. Очитавање се обавља најмање три пута. Алкохолну јачину очитану при температури t°C коригујемо за учинак температуре помоћу табеле 9. овог прилога. Температура течности мора се врло мало разликовати од собне температуре (највише 5°C).

2.3.2. ДЕНЗИМЕТРИЈА УПОТРЕБОМ ХИДРОСТАТИЧКЕ ВАГЕ

а) Апаратура

– Користити хидростатичку вагу описану у глави I. одељак 1.2.2. пододељак а) овог прилога.

б) Поступак

Густину дестилата на t°C мерити како је описано у глави I. одељак 1.2.2. пододељак б) овог прилога.

в) Исказивање резултата

Одредити алкохолну јачину на 20°C следећи методу описану у одељку 2.2. пододељак в) тачка 1) ове главе и коришћењем табеле 8. овог прилога, ако је пловак од Пирекс-стакла или коришћењем табеле 10. овог прилога, ако је пловак од обичног стакла.

2.3.3. РЕФРАКТОМЕТРИЈА

а) Апаратура

Рефрактометар који омогућује мерење индекса рефракције у распону од 1,330 до 1,346. У зависности од типа опреме, мерења се изводе:

– или на 20°C са погодним инструментом;

– или на собној температури t°C коришћењем инструмента опремљеног термометром који омогућава мерење температуре са тачношћу од 0,05°C. Табела за корекцију температуре треба бити придружена таквом инструменту.

б) Поступак

Индекс рефракције дестилата, који је добијен као што је то описано у одељку 2.1. пододељак г) ове главе, мери се следећи упутства приложена уз инструмент.

в) Исказивање резултата

Алкохолна јачина која одговара индексу рефракције очитаном на 20°C очитава се из табеле 11. овог прилога.

Напомена: Табела 11. овог прилога, даје алкохолне јачине које одговарају индексима рефракције за смеше алкохол-вода и за дестилате. У случају дестилата, морамо узети у обзир присутне нечистоће у дестилату (углавном више алкохоле). Присуство метанола снижава индекс рефракције па тиме и алкохолну јачину.

III. ОДРЕЂИВАЊЕ УКУПНОГ СУВОГ ЕКСТРАКТА

Укупан суви екстракт или укупна сува материја укључује све материје које нису испарљиве под специфичним физичким условима. Ови физички услови морају бити такви да материје које чине екстракт претрпе што је могуће мање промене у току испитивања.

Екстракт без шећера је разлика између укупног сувог екстракта и укупних шећера.

Редуковани екстракт је разлика између укупног сувог екстракта и укупних шећера изнад 1 g/l, калијум сулфата изнад 1 g/l, присутног манитола или других хемијских супстанци које су можда биле додате у вино.

Резидуални екстракт је екстракт без шећера и неиспарљивих киселина изражене као винска киселина.

Екстракт се изражава у грамима по литру и треба бити одређен унутар најближих 0,5 g.

a) Принцип методе

– Мерење са дензиметром.

б) Поступак

Укупан суви екстракт израчунава се индиректно из релативне густине шире, а за вино из релативне густине безалкохолног вина. Овај суви екстракт представља количину сахарозе која, растворена у 1 литру воде даје раствор исте релативне густине као шира или безалкохолно вино. Ова је количина приказана у табели 12. овог прилога.

в) Исказивање резултата

– Израчунавање:

Релативна густина (20/20), dr, безалкохолног вина израчунава се помоћу формуле:

dr = dv - da + 1,000

где је:

dv = релативна густина вина на 20°C (коригована за испарљиве киселине);1

da = релативна густина смеше вода–алкохол исте алкохолне јачине као и вино на 20°C.

Релативна густина (20/20), dr, се лако може израчунати из густине на 20°C густине вина dv и густине da смеше вода-алкохол исте алкохолне јачине као и вино, а према формули:

dr = 1,0018 (dv - da) + 1,000,

где се коефицијент 1,0018 приближава 1, кад је dv испод 1,05, што је најчешће и случај.

За прорачун укупног сувог екстракта у g/l требало би користити табелу 12. овог прилога, у којој је укупни суви екстракт у функцији релативне густине dr безалкохолног вина или из релативне густине шире d 20/20

Укупан суви екстракт изражава се у g/l са једним децималним местом.

–––––––––––––––

1 Пре овог прорачуна потребна је корекција релативне густине или густине вина на учинак испарљивих киселина, а коришћењем формуле:

где је а- испарљиве киселине изражене у милиеквивалентима по литру.

IV. ОДРЕЂИВАЊЕ РЕДУКУЈУЋИХ ШЕЋЕРА

Редукујући шећери су сви шећери, који имају кето или алдехидне функционалне групе. Њихово одређивање везано је за редукцију алкалног раствора бакар (II) соли.

Принцип методе

4.1. Пречишћавање вина:

4.1.1. Референтна метода: после неутрализације и уклањања алкохола, вино се пропушта кроз колону за измену јона у којој се његови анјони замењују јонима ацетата након чега следи пречишћавање неутралним олово ацетатом.

4.1.2. Уобичајене методе: вино пречишћавати једним од следећих реагенса:

4.1.2.1. неутрални олово ацетат;

4.1.2.2. цинк 2-хексацијаноферат.

4.2. Одређивање шећера

Пречишћено вино или шира реагује са одређеном количином алкалног раствора бакар (II) соли, а вишак јона бакра одређује се јодометријски.

4.1. ПРЕЧИШЋАВАЊЕ ВИНА

Концентрација редукујућих шећера у узорку који се анализира мора бити од 0,5 до 5 g/l. Сува вина не разређивати током пречишћавања, слатка вина се морају разредити у циљу постизања количине шећера унутар оквира прописаних у следећој табели:

4.1.1. РЕФЕРЕНТНА МЕТОДА

а) Реагенси

– 1 М раствор хлороводичне киселине, HCl;

– 1 М раствор натријум хидроксида, NaOH;

– 4 М раствор сирћетне киселине, CH3COOH;

– 2 М раствор натријум хидроксида, NaOH;

– смола анјонске измене [Dowex 3 (20-50 mesh) или еквивалентне смоле];

– неутрални раствор олово ацетата (приближно засићен): неутрални олово ацетат [Pb(CH3COO)2 x 3 H2O]: 250g; врло врућа вода: до 500 ml; мешати, док се потпуно не отопи;

– калцијум карбонат (CaCO3).

Припрема колоне за анјонску измену:

На дно бирете ставити мали уметак стаклене вуне и додати 15 ml анјонске смоле (одељак 4.1.1. пододељак а) алинеја пета ове главе). Пре употребе, смолу два пута регенерисати тако што је наизменично преливати са 1 М раствором хлороводичне киселине (одељак 4.1.1. пододељак а) алинеја прва ове главе) и 1 М раствором натријума хидроксида (одељак 4.1.1. пододељак а) алинеја друга ове главе). Након испирања са 50 ml дестиловане воде, преместити смолу у чашу, додати 50 ml 4 М раствора сирћетне киселине (одељак 4.1.1. пододељак а) алинеја трећа ове главе) и мешати пет минута. Поново напунити бирету смолом и на њу долити 100 ml 4 М раствора сирћетне киселине.

Напомена: пожељно је имати залиху смоле спремљену у боци напуњеној са 4 М раствором сирћетне киселине.

Колону испирати дестилованом водом док елуат не постане неутралан.

Регенерисање смоле:

У колону налити 150 ml 2 М раствора натријум хидроксида (одељак 4.1.1. пододељак а) алинеја четврта ове главе) да се одстрани киселина и већина пигмената везаних за смолу. Испрати са 100 ml воде и на то налити 100 ml 4 М раствора сирћетне киселине (одељак 4.1.1. пододељак а) алинеја трећа ове главе). Колону испирати са дестилованом водом док елуат не постане неутралан.

б) Поступак

– Сува вина:

Сипати 50 ml вина у чашу пречника од око 10 до 12 cm, додати 1/2 (n - 0,5) ml 1 М раствора натријум хидроксида (одељак 4.1.1. пододељак а) алинеја друга ове главе), (n је запремина 0,1 М раствора натријум хидроксида потребног за титрацију укупних киселина у 10 ml вина), па упаравати на воденом купатилу до око 20 ml. Ову течност пропустити кроз смолу анјонске измене у облику ацетата (одељак 4.1.1. пододељак а) алинеја пета ове главе) по 3 ml свака два минута. Елуат сакупљати у тиквицу од 100 ml. Испирати посуду и колону шест пута са по 10 ml дестиловане воде. Током мешања, елуату додати 2,5 ml засићеног раствора олово ацетата (одељак 4.1.1. пододељак а) алинеја шеста ове главе) и 0,5 g калцијум карбоната (одељак 4.1.1. пододељак а) алинеја седма ове главе), неколико пута промућкати и пустити да одстоји најмање 15 минута. Тиквицу допунити до ознаке и филтрирати. 1 ml овога филтрата одговара 0,5 ml вина.

– Шире, мистеле, слатка и полуслатка вина:

Разређења се праве према упутствима:

(1) Шире и мистеле: припремити 10% раствор узорка и за анализу узети 10 ml разређеног узорка;

(2) слатка вина, појачана или не, релативне густине између 1,005 и 1,038: припремити 20% раствор узорка и узети 20 ml разређеног узорка;

(3) полуслатка вина релативне густине на 20°C између 0,997 и 1,005: узети 20 ml неразређеног вина.

Пропуштати горе наведену запремину вина или шире кроз колону анјонске измене у облику ацетата брзином од 3 ml свака два минута. Елуат сакупљати у тиквицу од 100 ml, колону испирати водом док се не добије око 90 ml елуата. Елуату додати 0,5 g калцијум карбоната и 1 ml засићеног раствора олово ацетата. Промућкати, оставити да одстоји најмање 15 минута мешајући га повремено. Долити воду до ознаке и филтрирати.

У случајевима из подтач. (1), (2) и (3) овог пододељка, разређења одговарају следећим количинама:

– 1 ml филтрата одговара 0,01 ml шире или мистеле,

– 1 ml филтрата одговара 0,04 ml слатког вина,

– 1 ml филтрата одговара 0,20 ml полуслатког вина.

4.1.2. УОБИЧАЈЕНЕ МЕТОДЕ

4.1.2.1. ПРЕЧИШЋАВАЊЕ СА НЕУТРАЛНИМ ОЛОВО АЦЕТАТОМ

а) Реагенси

– Раствор неутралног олово ацетата, приближно засићеног (у одељку 4.1.1. пододељак а) алинеја шеста ове главе);

– калцијум карбонат.

б) Поступак

1) Сува вина:

50 ml вина улити у одмерну тиквицу од 100 ml, додати 1/2 (n - 0,5) ml 1 М раствора натријум хидроксида (у одељку 4.1.1. пододељак а) алинеја друга ове главе); где је n запремина 0,1 М натријум хидроксида употребљена за одређивање укупних киселина у 10 ml вина. Уз мешање додати 2,5 ml засићеног раствора олово ацетата (у одељку 4.1.1. пододељак а) алинеја шеста ове главе) и 0,5 g калцијум карбоната (у одељку 4.1.1. пододељак а) алинеја седма ове главе). Садржај тиквице промућкати неколико пута и оставити да одстоји најмање 15 минута. Допунити до ознаке водом и филтрирати. 1 ml филтрата одговара 0,5 ml вина.

2) Шире, мистеле, слатка и полуслатка вина:

Разређења се праве према упутствима:

(1) Шире и мистеле: припремити 10% раствор узорка и за анализу узети 10 ml тога разређеног узорка;

(2) слатка вина, појачана или не, релативне густине између 1,005 и 1,038: припремити 20% раствор узорка и узети 20 ml разређеног узорка;

(3) полуслатка вина густине између 0,997 и 1,005 на 20°C: узети 20 ml неразређеног узорка.

Додати 0,5 g калцијум карбоната, око 60 ml воде и 0,5, 1 или 2 ml засићеног раствора олово ацетата. Промешати и оставити да стоји најмање 15 минута, мешајући повремено. Допунити водом до ознаке и филтрирати.

У случајевима из подтaч. (1), (2) и (3) ове тачке разређења одговарају следећим количинама:

– 1 ml филтрата одговара 0,01 ml шире или мистеле,

– 1 ml филтрата одговара 0,04 ml слатка вина,

– 1 ml филтрата одговара 0,20 ml полуслатка вина.

4.1.2.2. ПРЕЧИШЋАВАЊЕ СА ЦИНК-2-ХЕКСАЦИЈАНОФЕРАТОМ

Овај поступак користити само за бела вина, светла слатка вина и шире.

а) Реагенси

– Раствор I: калијум 2-хексацијаноферата:

Калијум 2-хексацијаноферат [K4Fe(CN)6 x 3H2O], 150 g; допунимо водом до 1000 ml.

– Раствор II: цинк сулфата:

Цинк сулфат, ZnSO4 x 7H2О, 300 g; допунимо водом до 1000 ml.

б) Поступак

У одмерну тиквицу од 100 ml улити узорак вина (или шире или мистеле); разређења су наведена према следећим упутствима:

1) Шире и мистеле: припремити 10% раствор узорка и за анализу узети 10 ml разређеног узорка;

2) слатка вина, појачана или не, релативне густине између 1,005 и 1,038: припремити 20% раствор узорка и узети 20 ml разређеног узорка;

3) полуслатка вина релативне густине између 0,997 и 1,005: узети 20 ml неразређеног узорка;

4) сува вина: узети 50 ml неразређеног узорка.

Додати 5 ml раствора I, калијум 2-хексацијанoферата (одељак 4.1.2.2. пододељак а) алинеја прва ове главе) и 5 ml раствора II, цинк сулфата (одељак 4.1.2.2. пододељак а) алинеја друга ове главе). Промешати, допунити водом до oзнаке, оставити да стоји 10 минута и филтрирати.

У случајевима из тaч. 1), 2), 3) и 4) овог пододељка разређења одговарају следећим количинама:

– 1 ml филтрата одговара 0,01 ml шире или мистеле;

– 1 ml филтрата одговара 0,04 ml слатког вина;

– 1 ml филтрата одговара 0,20 ml полуслатког вина;

– 1 ml филтрата одговара 0,50 ml сувог вина.

4.2. ОДРЕЂИВАЊЕ ШЕЋЕРА

а) Реагенси

– Алкални раствор соли бакра:

бакар (II) сулфат, (CuSО4 x 5H2О): 25 g; лимунска киселина (C6H8О7 x H2О): 50 g; натријум карбонат (Na2CО3 x 10H2О): 388 g; вода: до 1000 ml. Бакар (II) сулфат растворити у 100 ml воде, лимунску киселину у 300 ml воде и натријум карбонат у 300 до 400 ml вруће воде. Помешати растворе лимунске киселине и натријум карбоната. Додати им раствор бакар (II) сулфата и допунити водом до 1 литра;

– 30 % раствор калијум јодида:

калијум јодид (КI): 30g; вода: до 100 ml; раствор чувати у тамној боци;

– 25 % раствор сумпорне киселине:

концентрована сумпорна киселина (H2SO4), ρ20 = 1,84 g/ml: 25 g; вода: до 100 ml. Киселину полако додавати у воду, причекати да се охлади и допунити са водом до 100 ml;

– раствор скроба, 5 g/l:

5 g скроба помешати са око 500 ml воде. Уз стално мешање грејати до кључања, оставити да ври 10 минута. Додати 200 g натријум хлорида (NaCl), охладити и допунити водом до 1 литре;

– 0,1 М раствор натријум тиосулфата;

– раствор инвертног шећера, 5 g/l, (за проверу методе одређивања).

У одмерну тиквицу од 200 ml додати: чисту суву сахарозу (C12H22O11): 4,75 g; воду: приближно 100 ml; концентровану хлороводоничну киселину (HCl), ρ20 = од 1,16 до 1,19 g/ ml: 5 ml. Тиквицу грејати на воденом купатилу на 60°C док температура раствора не достигне 50°C; температуру одржавати 15 минута. Тиквицу хладити на ваздуху 30 минута и тада је уронити у хладну воду. Раствор пренети у одмерну тиквицу од 1 литра и допунити до ознаке. Овај раствор је постојан месец дана. Кад се користи, испитивани узорак (раствор има апроксимативно 0,06 М HCl) неутралисати раствором натријум хидроксида.

б) Поступак

У тиквици од 300 ml помешати 25 ml алкалног раствора соли бакра (одељак 4.2. пододељак а) алинеја прва ове главе), 15 ml воде и 10 ml пречишћеног раствора узорка (одељак 4.2. пододељак а) алинеја шеста ове главе). Ова запремина раствора не сме садржати више од 60 mg инвертног шећера. Додати неколико куглица за кључање, на тиквицу наместити повратни хладњак и загрејати до кључања у року од двa минутa. Нека мешавина кључа тачно 10 минута. Охладити тиквицу у млазу хладне воде. Кад се потпуно охлади, додати 10 ml 30% раствора калијум јодида (одељак 4.2. пододељак а) алинеја друга ове главе), 25 ml 25% сумпорне киселине (одељак 4.2. пододељак а) алинеја трећа ове главе) и 2 ml раствора скроба (одељак 4.2. пододељак а) алинеја четврта ове главе). Титрирати са 0,1 М раствором натријум тиосулфата (одељак 4.2. пододељак а) алинеја пета ове главе), број утрошених милилитара натријум тиосулфата означити са n. За титрацију слепе пробе, 10 ml раствора шећера заменити са 10 ml дестиловане воде, број милилитара утрошеног натријум тиосулфата за титрацију слепе пробе означити са n‘.

в) Исказивање резултата

1) Израчунавање:

Маса редукујућих шећера, изражена као инвертни шећер, садржана у узорку дата је у табели 13. овог прилога, као функција броја (n‘ - n) утрошених милилитара натријум тиосулфата. Масу редукујућих шећера изражавати у грамима инвертног шећера по литру, на једно децимално место, узимајући у обзир разређење у току пречишћавања и запремину испитиваног узорка.

2) Поновљивост, (r): r = 0,015xi

где је xi концентрација инвертног шећера у g/l узорка.

3) Репродуктивност, (R): R = 0,058 xi

где је xi концентрација инвертног шећера у g/l узорка.

V. ОДРЕЂИВАЊЕ ПЕПЕЛА

Садржај пепела дефинише се као суви несагориви остатак који заостаје после испаравања испарљивих састојака и сагоревања (спаљивања) органских материја. Спаљивање се изводи тако да се сви катјони (искључивши катјон амонијума) претворе у карбонате или друге безводне неорганске соли.

а) Принцип методе

Екстракт вина жарити на температури између 500°C и 550°C до потпуне оксидације органских материја.

б) Апаратурa

– водено купатило;

– вага са тачношћу 0,1 mg;

– решо или инфра-црвени евапоратор;

– елекрична пећ са контролисаном температуром;

– платинска посуда равног дна, пречника 70 mm и висине 25 mm.

в) Поступак

У претходно измерену платинску посуду (почетна маса P0) одпипетирати 20 ml вина. Отпарити до сувог на кључалом воденом купатилу, остатак сагорети на решоу на 200°C или под инфра-црвеним евапоратором док не започне угљенисање. Кад престане да се развија дим, ставити посуде у електричну пећ на 525°C +/-25°C. Након 15 минута угљенисања, извадити посуду из пећи, додати 5 ml дестиловане воде, испарити на воденом купатилу или под инфра-црвеним евапоратором и остатак поново жарити на 525°C 10 минута. Ако сагоревање (оксидација угљенисаних честица) није потпуно, понављати поступак додавања воде, испаравања воде и жарења.

Напомена: за вина са великим садржајем редукујућих шећера, препоручује се додатак неколико капи чистог биљног уља у екстракт вина (пре првог жарења да се спречи стварање пене). Када пепео постане беле боје, платинску посуду охладити у ексикатору и мерити (маса P1). Маса пепела у узорку (20 ml) једнака је P = (P1 - Pо ) g.

г) Исказивање резултата:

Маса пепела А у грамима по литру добиће се на два децимална места изразом:

А = 50 × P.

VI. ОДРЕЂИВАЊЕ pH

Мерити разлику у потенцијалу између две електроде уроњене у испитивану течност. Потенцијал једне од електрода је у функцији pH вредности течности, док друга електрода има сталан и познат потенцијал па представља референтну електроду.

а) Апаратура:

– pH метар са скалом калибрисаном у јединицама pH, тако да омогућава мерења до тaчности од најмање 0,05 pH јединице;

– електроде: стаклена електрода која се држи у дестилованој води;

– каломел електрода – референтна: држи се у засићеном раствору калијум хлорида;

– или комбинована електрода која се држи у дестилованој води.

б) Реагенси – пуферни раствори

– Засићени раствор калијум хидроген тартарата, са најмање 5,7 g калијум хидроген тартарата по литру (C4H5KO6) на 20°C. (Овај раствор се може држати до два месеца ако му се дода 0,1 g тимола на 200 ml).

pH вредност: 3,57 на 20°C;

3,56 на 25°C;

3,55 на 30°C.

– 0,05 М раствор калијум хидроген фталата, који садржи 10,211 g калијум хидроген фталата (C8H5КО4) на 20°C. (Раствор се може држати максимално два месеца).

pH вредност: 3,999 на 15°C;

4,003 на 20°C;

4,008 на 25°C;

4,015 на 30°C.

– Раствор који садржи: монокалијум фосфат, КH2PО4: 3,402 g; дикалијум фосфат, К2HPО4: 4,354 g; вода до 1000 ml. (Раствор се може држати максимално два месеца.)

pH вредност: 6,90 на 15°C;

6,88 на 20°C;

6,86 на 25°C;

6,85 на 30°C.

Напомена: Могу се користити и комерцијални референтни пуферни раствори.

в) Поступак

1) Припрема узорка за анализу:

– Ширу и вино мерити директно.

– Ректификована концентрована шира: разредити ректификовану концентровану ширу водом да се добије концентрација од 25 +/- 0,5% (m/m) укупних шећера (25° Brix). Ако је P концентрација (m/m) укупних шећера у ректификованој концентрованој шири, измерити масу од 2500/P и допунити до 100 g водом. Проводљивост употребљене воде мора бити испод 2 микросименса по cm (μS/cm).

2) Намештање нуле апарата:

Пре мерења апаратуру треба наместити на нулу према приложеном упутству.

3) Калибрација pH метра:

pH метар калибрисати на 20 са пуферским растворима pH 6,88 и 3,57. Користити пуферски раствор pH 4,00 при 20°C да би проверили скалу.

4) Oдређивање pH:

Електроду уронити у узорак на температури између 20°C и 25°C и то што је могуће ближе 20°C. Вредност pH директно се прочита са скале. Сваки узорак измеримо два пута. Коначни резултат је аритметичка средина два мерења.

г) Исказивање резултата:

Вредност pH шире, вина или раствора 25% (m/m) (25°Brix) ректификоване концентроване шире се изражава на два децимална места.

VII. ОДРЕЂИВАЊЕ УКУПНИХ КИСЕЛИНА

Укупне киселине вина представљају збир његових титрационих киселина када се оне титрирају до pH 7 са стандардним алкалним раствором. Угљен диоксид није укључен у укупне киселине.

а) Принцип методе

Потенциометријска титрација или титрација уз индикатор бромтимол плаво и упоређивање са завршном тачком бојеног стандарда.

б) Апаратура

– Водена вакуум пумпа;

– вакуум тиквица од 500 ml;

– потенциометар са скалом у вредностима pH и електрода. Стаклена електрода мора се држати у дестилованој води. Каломел електрода мора се држати у засићеном раствору калијум хлорида. Комбинована електрода која се користи мора се држати у дестилованој води;

– мерни цилиндри: за вино од 50 ml, за ректификоване концентроване шире од 100 ml.

в) Реагенси

1) Пуферни раствор pH 7,0:

– монокалијум фосфат (KH2PO4): 107,3 g;

– 1 М раствор натријум хидроксида (NaOH): 500 ml;

– дестилована вода: до 1000 ml.

Могу се користити комерцијални пуферни раствори.

2) 0,1 М раствор натријум хидроксида (NaOH).

3) Раствор индикатора бромтимол плаво концентрације 4 g/l:

– бромтимол плаво (C27H28Br2O5S): 4 g;

– неутрални етанол, 96%: 200 ml.

Спојимо растворе и додамо:

– дегазирану воду (без CО2): 200 ml;

– 1 М раствор натријум хидроксида, до појаве модро-зелене боје (pH 7): приближно 7,5 ml.

Допунити дестилованом водом до 1000 ml.

г) Поступак

1) Припрема узорка:

– Вино:

Одстрањивање угљен диоксида: улити око 50 ml вина у вакуум тиквицу и прикључити на водену вакуум пумпу 1–2 минута, мешајући га континуирано.

– Ректификована концентрована шира:

Измерити тачно 200 g ректификоване концентроване шире у одмерну тиквицу од 500 ml и допунити водом до ознаке и хомогенизовати.

2) Потенциометријска титрација

– Калибрација pH метра: pH метар мора бити подешен за рад на темепратури од 20°C у складу с упутствима произвођача, са пуферним раствором pH 7 на 20°C.

– Метода мерења: у мерни цилиндар (пододељак б) алинеја четврта ове главе) улити одређену запремину узорка, што је 10 ml у случају вина, а 50 ml ректификоване концентроване шире (пододељак г) тачка 1) ове главе). Додати приближно 10 ml дестиловане воде и титрирати са 0,1 М раствором натријум хидроксида (пододељак в) тачка 2) ове главе) из бирете док pH не буде 7 на 20°C. Раствор натријум хидроксида додавати уз стално мешање. Означити запремину додатог 0,1 М раствора натријум хидроксида са n (ml).

3) Титрација у присуству индикатора (бромтимол плаво)

– Прелиминарани тест: одређивање боје у завршној тaчки:

У мерни цилиндар (пододељак б) алинеја четврта ове главе) улити 25 ml кључале дестиловане воде, 1 ml раствора бромтимол плавог (пододељак в) тачка 3) ове главе) и запремину од 10 ml узорка у случају вина, а 50 ml ако се ради о ректификованој концентрованој шири, (припремљеног како је описано у пододељку г) тачка 1) ове главе). Додати раствор 0,1 М натријум хидроксида (пододељак в) тачка 2) ове главе) док се боја не промени у модро-зелену. Тада додати 5 ml пуферног раствора pH 7 (пододељак в) тачка 1) ове главе).

– Титрација:

У мерни цилиндар (пододељак б) алинеја четврта ове главе) улити 30 ml кључале дестиловане воде, 1 ml раствора бромтимол плаво и запремину узорка (10 ml у случају вина, а 50 ml ако се ради о ректификованој концентрованој шири) припремљеног како је описано у пододељку г) тачка 1) ове главе. Додати раствор 0,1 М натријум хидроксида (пододељак в) тачка 2) ове главе) док се не добије иста боја као и у прелиминарном тесту (алинеја прва ове тачке). Запремину додатог 0,1 М раствора натријум хидроксида означити са n ml.

д) Исказивање резултата

1) Израчунавање:

(1) Вино:

Укупне киселине, изражене у милиеквивалентима по литру (А) израчунавати:

А = 10 × f × n

где је:

f – корекциони фактор за 0,1 М натријум хидроксида;

n – утрошак 0,1 М натријум хидроксида. Резултат изражавати на једно децимало место.

Укупне киселине изражене у грамима винске киселине по литру (А‘), израчунавати:

А‘= 0,075 × А

Резултат изражавати на једно децимално место.

(2) Ректификована концентрована шира:

Укупне киселине, изражене у милиеквивалентима по килограму ректификоване концентроване шире (А), израчунавати:

А = 5 × f × n

где је:

f – корекциони фактор за 0,1 М натријум хидроксида;

n – утрошак 0,1 М натријум хидроксида.

Укупне киселине, изражене у милиеквивалентима по килограму укупних шећера (А), израчунавати:

А = (500 × n) / P

где је P концентрација (m/m) укупних шећера. Резултат изражавати на једно децимално место.

2) Поновљивост (r) за титрацију с индикатором:

За бела, роза и црвена вина:

р = 0,9 mekv/l,

р = 0,07 g винске киселине/l.

3) Репродуктивност (R) за титрацију с индикатором:

За бела и роза вина:

Р = 3,6 mekv/l,

Р = 0,3 g винске киселине/l.

За црвена вина:

Р = 5,1 mekv/l,

Р = 0,4 g винске киселине/l.

VIII. ОДРЕЂИВАЊЕ ИСПАРЉИВИХ КИСЕЛИНА

Испарљиве киселине представљају хомологе сирћетне киселине који су присутни у вину у слободном облику или у облику соли.

а) Принцип методе

Титрација дестилата и неутрализација испарљивих киселина издвојених из вина, дестилацијом воденом паром.

Из вина се најпре издвоји угљен диоксид. Киселост дестилата мора бити коригована за киселост слободног и везаног сумпор диоксида у дестилату који се добија под овим условима. Киселост сорбинске киселине која је додата вину мора се одузети од испарљивих киселина.

Напомена: део салицилне киселине, која се у неким земљама користи за стабилизацију вина, може бити присутан у дестилату. Количина салицилне киселине мора бити одређена и одузета од испарљивих киселина. Метода за одређивање салицилне киселине дата је у пододељку ђ) ове главе.

б) Апаратура

1) Апаратура за дестилацију воденом паром је састављена од:

– генератора водене паре (пара мора бити без угљен диоксида);

– тиквице са цевима за пару;

– колоне за дестилацију;

– хладњака.

Опрема мора задовољити следећа три теста:

(1) У тиквицу улити 20 ml кључале воде. Сакупити 250 ml дестилата, додати 0,1 ml 0,1 М раствора натријум хидроксида и две капи раствора фенолфталеина. Ружичаста боја мора бити постојана најмање 10 секунди. То значи да пара не садржи угљен диоксид.

(2) У тиквицу улити 20 ml 0,1 М раствора сирћетне киселине. Сакупити 250 ml дестилата и титрирати са 0,1 М раствором натријум хидроксида. Запремина утрошеног NaOH мора бити најмање 19,9 ml. То значи да је предестиловано најмање 99,5% сирћетне киселине.

(3) У тиквицу улити 20 ml 1 М раствора млечне киселине. Сакупити 250 ml дестилата и титрирати киселину са 0,1 М раствором натријум хидроксида. Запремина утрошеног раствора натријум хидроксида мора бити мања или једнака 1,0 ml, што значи да се предестиловало не више од 0,5% млечне киселине.

Свака апаратура или поступак, који задовољава ове тестове испуњава захтеве службених међународних апаратура или поступака.

2) Водена пумпа.

3) Вакуум тиквица.

в) Реагенси

– Кристализована винска киселина (C4H6О6);

– 0,1 М раствор натријум хидроксида (NaОH);

– 1% раствор фенолфталеина у 96% неутралном алкохолу;

– хлороводонична киселина, HCl (ρ20 = 1,18 до 1,19 g/l) разређена 1:4 (v/v);

– 0,005 М раствор јода (I2);

– кристализовани калијум јодид (KI);

– раствор скроба, 5 g/l (5g скроба помешати са око 500 ml воде; уз стално мешање, загрејати до врења и оставити да ври 10 минута; додати 200 g натријум хлорида; када се охлади разредити до једног литра);

– засићени раствор натријум бората (Na2B4О7 x 10 H2О), концентрације приближно 55 g/l при 20°C.

г) Поступак

1) Припремање узорка: одстрањивање угљен диоксида; у вакуум тиквицу улити приближно 50 ml вина; помоћу водене пумпе успоставити вакуум у тиквици на пар минута, тресући вино непрестано.

2) Дестилација воденом паром:

У тиквицу улити 20 ml вина ослобођеног од угљен диоксида као што је то описано у тачки 1) овог пододељка. Додати приближно 0,5 g винске киселине (пододељак в) алинеја прва ове главе). Сакупити најмање 250 ml дестилата.

3) Титрација:

Титрирати са 0,1 М раствора натријум хидроксида (пододељак в) алинеја друга ове главе) уз додатак две капи фенолфталеина (пододељак в) алинеја трећа ове главе) као индикатора. Означити запремину употребљеног натријум хидроксида n (ml). Додати четири капи разређене хлороводоничне киселине (пододељак в) алинеја четврта ове главе), 2 ml раствора скроба (пододељак в) алинеја седма ове главе) и неколико кристала калијум јодида (пододељак в) алинеја шеста ове главе). Титрирати слободан сумпор диоксид са 0,005 М раствора јода (пододељак в) алинеја пета ове главе). Означити употребљену запремину са n‘. Додати засићени раствор натријум бората (пододељак в) алинеја осма ове главе) док се опет не појави ружичаста боја. Титрирати укупни сумпор диоксид са 0,005 М раствором јода (пододељак в) алинеја пета ове главе). Означити употребљену запремину 0,005 М раствора јода са n‘‘.

д) Исказивање резултата

1) Израчунавање:

Испарљиве киселине, изражене у милиеквивалентима по литру, на једно децимално место, дате су формулом:

А = 5 × (n × f - 0,1 × f‘ × n‘ – 0,05 × f ‚ × n‘‘)

где је:

n – утошак 0,1 М натријум хидроксида;

n‘ – утрошак 0,005 М раствора јода;

n‘‘ – утрошак 0,005 М раствора јода;

f – корекциони фактор 0,1 М натријум хидроксида;

f‘ – корекциони фактор 0,005 М раствора јода.

Испарљиве киселине, изражене у грамима сирћетне киселине по литру, изражене на два децимална места, дате су формулом:

А = 0,300 x (n × f - 0,1 × f ‚ × n‘ – 0,05 × f ‚ × n‘‘)

где је:

n – утошак 0,1 М натријум хидроксида;

n‘ – утрошак 0,005 М раствора јода;

n‘‘ – утрошак 0,005 М раствора јода;

f – корекциони фактор 0,1 М натријум хидроксида;

f‘ – корекциони фактор 0,005 М раствора јода.

2) Поновљивост (r):

r = 0,7 mekv/l;

r = 0,04 g сирћетне киселине/l.

3) Репродуктивност (R):

R = 1,3 mekv/l;

R = 0,08 g сирћетне киселине/l.

4) Вино са присутном сорбинском киселином:

Како се 96% сорбинска киселина дестилује воденом паром у дестилат запремине 250 ml, њена киселост мора бити одузета од испарљивих киселина. 100 mg сорбинске киселине одговара киселости од 0,89 милиеквивалената или 0,053 g сирћетне киселине. Концентрацију сорбинске киселине у mg/l одређујемо другим методама.

ђ) Одређивање салицилне киселине у дестилату за испитивање садржаја испарљивих киселина

1) Принцип

Након што се одреде испарљиве киселине са корекцијом за сумпор диоксид, присутност салицилне киселине доказује се појавом љубичасте боје, након закишељавања и додатка соли гвожђа (III).

Одређивање салицилне киселине садржане у дестилату са испарљивим киселинама изводи се у другом дестилату исте запремине као и дестилат у коме су одређене испарљиве киселине. У овом дестилату салицилна киселина се одређује колориметријском методом. Добијена количина се одузима од испарљивих киселина дестилата.

2) Реагенси:

– Хлороводонична киселина, HCl (ρ20 = 1,18 до 1,19 g/l);

– 0,1 М раствор натријум тиосулфата, (Na2S2О3 x 5H2О);

– 10% раствор гвожђе (III) амонијум сулфата [(Fe2(SО4)3 x (NH4)2SО4 x 24H2О)];

– 0,01 М раствор натријум салицилата: раствор садржи 1,60 g/l натријум салицилата (NaC7H5О3).

3) Поступак:

– Одређивање салицилне киселине у дестилату испарљивих киселина:

Непосредно после одређивања испарљивих киселина и корекције на слободни и укупни сумпор диоксид, улити у конусну тиквицу 0,5 ml хлороводоничне киселине (тачка 2) алинеја прва овог пододељка), 3 ml 0,1 М раствора натријум тиосулфата (тачка 2) алинеја друга овог пододељка) и 1 ml раствора гвожђе (III) амонијум сулфата (тачка 2) алинеја трећа овог пододељка). У присуству салицилне киселине појавиће се љубичасто обојење.

– Одређивање салицилне киселине:

На конусној тиквици означити ниво дестилата. Испразнити и испрати тиквицу. У исту тиквицу додати нових 20 ml вина, дестиловати воденом паром и скупити дестилат у конусну тиквицу до означеног нивоа. Додати 0,3 ml хлороводичне киселине (тачка 2) алинеја прва овог пододељка) и 1 ml раствора гвожђе (III) амонијум сулфата (тачка 2) алинеја трећа овог пододељка). Садржај конусне тиквице обоји се љубичасто.

У конусну тиквицу, идентичну тиквици из првог става ове тачке, додати дестиловану воду до означеног нивоа. Додати 0,3 ml хлороводоничне киселине (тачка 2) алинеја прва овог пододељка), и 1 ml раствор гвожђе (III) амонијум сулфата (тачка 2) алинеја трећа овог пододељка). Из бирете додати 0,01 М раствор натријум салицилата (тачка 2) алинеја четврта овог пододељка) све док раствор не поприми исту љубичасту боју као она у конусној тиквици с винским дестилатом.

Запремину раствора, која је додата из бирете означимо са n‘‘ (ml).

– Корекција испарљивих киселина:

Од запремине n 0,1 М раствора натријум хидроксида, употребљеног за титрацију испарљивих киселина одузети 0,1 x n‘‘ (ml).

IX. ОДРЕЂИВАЊЕ НЕИСПАРЉИВИХ КИСЕЛИНА

Неиспарљиве киселине представљају разлику између укупних и испарљивих киселина. Неиспарљиве киселине изражавати у:

– милиеквивалентима по литру (mekv/l);

– грамима винске киселине по литру (g винске киселине/l).

X. ОДРЕЂИВАЊЕ УКУПНОГ И СЛОБОДНОГ СУМПОР ДИОКСИДА

Слободни сумпор диоксид дефинисан је као сумпор диоксид који је присутан у шири или вину у следећим облицима:

H2SО3 и HSО3–

Равнотежа између ових облика је функција pH и температуре:

H2SО3 <——> H+ + HSО3–

Укупни сумпор диоксид дефинисан је као сума свих различитих облика сумпор диоксида присутних у вину, било да је у слободном стању или комбинован са састојцима вина.

Принцип методе

10.1. Референтна метода:

– За вина и шире:

Сумпор диоксид издвајати из вина у струји ваздуха или инертног гаса азота; везати и оксидисати га тако да се мехурићима проводи кроз разређени и неутрални раствор водоник пероксида. Насталу сумпорну киселину одредити титрацијом са стандардним раствором натријум хидроксида.

Слободни сумпор диоксид издвајати из вина на ниској температури (10°C).

Укупни сумпор диоксид издвајати из вина загревањем на високој температури (приближно 100°C).

– За ректификовану концентровану ширу:

Укупни сумпор диоксид издвајати из претходно разређене ректификоване концентроване шире загревањем на високој температури (приближно 100°C).

10.2. Брза метода:

За вина и шире:

Слободни сумпор диоксид одредити директно јодометријском титрацијом.

Везани сумпор диоксид накнадно одредити јодометријском титрацијом након алкалне хидролизе. Овај резултат придодати резултату слободног сумпор диоксида и збир представља укупни сумпор диоксид.

10.1 РЕФЕРЕНТНА МЕТОДА

а) Апаратура

– Апаратура, која се користи мора се слагати са сликом 2. Посебну пажњу потребно је посветити хладњаку.

Слика 2: Димензије су у милиметрима. Унутрашњи пречници
четири концентричне цеви што чине хладњак су: 45, 34, 27 и 10 mm.

Цев која изводи гас из узорка се у тиквици B завршава једном малом куглом пречника 1 cm која има 20 рупица пречника 0,2 mm око свог највећег обима. Изузетно, ова цев се може завршавати стакленом порозном плочицом која ствара велики број врло малених мехурића и осигурава добар контакт између течне и гасовите фазе.

Проток гаса кроз апаратуру требало би да износи приближно 40 литара на сат. Боца на десној страни слике 2. намењена је спречавању пада притиска који настаје због водене вакуум пумпе, на 20 до 30 cm воде. За регулацију правилног вакуума, између тиквице и боце требало би поставити мерач протока са полукапиларном цевчицом.

– Микро-бирета.

б) Реагенси

– Фосфорна (ортофосфорна) киселина, 85 % (H3PО4, p20 = 1,71 g/ml);

– раствор водоник пероксида, 9,1 g H2О2 / литру (три волумена);

– индикатор: метил црвено: 100 mg; метиленско плаво: 50 mg; алкохол, 50 %: 100 ml;

– 0,01 М раствор натријум хидроксида, NaOH.

в) Поступак

1) Одређивање слободног сумпор диоксида:

Вино се мора држати у пуној и зачепљеној боци на 20°C два дана пре одређивања. У тиквицу B ставити 2 до 3 ml раствора водоник пероксида (одељак 10.1. пододељак б) алинеја друга ове главе) и две капи индикатора (одељак 10.1. пододељак б) алинеја трећа ове главе). Раствор водоник пероксида неутралисати са раствором 0,01 М натријум хидроксида (одељак 10.1. пододељак б) алинеја четврта ове главе) и спојити тиквицу Б са апаратуром. У тиквицу А улити 50 ml узорка и 15 ml фосфорне киселине (одељак 10.1. пододељак б) алинеја прва ове главе) и спојити са апаратуром. Проводити мехуриће ваздуха (или азота) 15 минута. Ослобођени сумпор диоксид се у тиквици B оксидише у сумпорну киселину. Тиквицу В скинути са апаратуре и титрирати насталу киселину са 0,01 М раствором натријум хидроксида (одељак 10.1. пододељак б) алинеја четврта ове главе). Утрошену запремину за титрацију означити са n (ml).

(1) Исказивање резултата

Ослобођени сумпор диоксид изражава се у mg/l, на најближи цео број.

(2) Израчунавање:

– Слободни сумпор диоксид у mg/l добија се из производа 6,4 × f × n

где је:

f – корекциони фактор 0,01 М натријум хидроксида;

n – утрошак 0,01 М натријум хидроксида.

2) Одређивање укупног сумпор диоксида:

– Ректификована концентрована шира:

У случају ректификоване концентроване шире користити раствор, добијен разређивањем узорка до 40 % (m/v) како је описано у глави VII. пододељак г) тачка 1) алинеја друга овог прилога. У тиквицу А од 250 ml сипати 50 ml разређеног узорка и 5 ml фосфорне киселине (одељак 10.1. пододељак б) алинеја прва ове главе). Тиквицу А спојити на апаратуру.

– Шире и вина:

Ако очекивана концентрација укупног SO2 у узорку није већа од 50 mg/l, ставити 50 ml узорка и 15 ml ортофосфорне киселине (одељак 10.1. пододељак б) алинеја прва ове главе) у тиквицу А од 250 ml и спојити на апаратуру.

Ако је очекивана концентрација укупног SO2 у узорку већа од 50 mg/l, ставити 20 ml узорка и 5 ml ортофосфорне киселине (одељак 10.1. пододељак б) алинеја прва ове главе) у тиквицу А од 250 ml и спојити апаратуру.

У тиквицу B ставити 2 до 3 ml раствора водоник пероксида (одељак 10.1. пододељак б) алинеја друга ове главе), неутралисати по поступку у складу са одељком 10.1. пододељак в) тачка 1) ове главе. Вино у тиквици А загрејати до кључања помоћу пламена висине од 4 до 5 cm, који директно дотиче дно тиквице. Тиквица се не сме ставити на металну плочу, већ на диск пречника отприлике 30 cm са рупом у средини.

Тако се избегава прегревање супстанци екстрахованих из вина које се таложе на зидове тиквице.

Одржавати кључање док кроз апаратуру струји ваздух (или азот). За 15 минута сав сумпор диоксид се ослободи и оксидише. Насталу сумпорну киселину титрирати са 0,01 М раствором натријум хидроксида (одељак 10.1. пододељак б) алинеја четврта ове главе). Утрошену запремину за титрацију означити са n (ml).

(1) Исказивање резултата

– Шире и вина: укупни сумпор диоксид се исказује у mg/l.

– Ректификована концентрована шира: укупни сумпор диоксид се исказује у mg/kg укупних шећера.

(2) Израчунавање:

– Вино:

Укупни сумпор диоксид у милиграмима по литру, где концентрација SО2 у узорку није већа од 50 mg/l, (50 ml узорка):

6,4 × f × n

где је:

f – корекциони фактор 0,01 М натријум хидроксида;

n – утрошак 0,01 М натријум хидроксида.

Укупни сумпор диоксид у милиграмима по литру, где је концентрација SО2 у узорку већа од 50 mg/l, (20 ml узорка):

16 × f × n

где је:

f – корекциони фактор 0,01 М натријум хидроксида;

n – утрошак 0,01 М натријум хидроксида.

– Ректификована концентрована шира:

Укупни сумпор диоксид у mg/kg укупних шећера (50 ml припремљеног узорка):

(1600 × n)/P

где је

P масена концентрација (m/m) укупних шећера.

(3) Поновљивост (r):

за 50 ml узорка (концентрација SО2 у узорку није већа од 50 mg/l); r = 1 mg/l, за 20 ml узорка (концентрација SО2 у узорку је већа од 50 mg/l); r = 6 mg/l.

(4) Репродуктивност (R):

за 50 ml узорка (концентрација SО2 у узорку није већа од 50 mg/l); R = 9 mg/l, за 20 ml узорка (концентрација SО2 у узорку је већа од 50 mg/l); R= 15 mg/l.

10.2. БРЗА МЕТОДА

а) Апаратура

– тиквица од 500 ml;

– бирета;

– пипете од 1, 2, 5 и 50 ml.

б) Реагенси

– EDTA комплексон III: ди-натријумова со етилен диамин тетра-сирћетна киселина (C10H14N2О8Na2 × 2H2О);

– 4М раствор натријум хидроксида, NaOH, (160 g/l);

– сумпорна киселина H2SО4 (p20= 1,84 g/ml), разређена 1:10 (v/v);

– раствор скроба 5 g/l: 5g скроба помешати са око 500 ml воде; грејати до кључања уз стално мешање и оставити да кључа 10 минута; додати 200 g натријум хлорида (NaCl). Након што се охлади, допунити до једног литра;

– 0,025 М раствора јода, I2.

в) Поступак

1) Слободни сумпор диоксид

У тиквицу од 500 ml додати:

– 50 ml вина,

– 5 ml раствора скроба (одељак 10.2. пододељак б) алинеја четврта ове главе),

– 30 mg EDTA комплексoн III (одељак 10.2. пододељак б) алинеја прва ове главе),

– 3 ml раствора сумпорне киселине 1:10 (v/v) (одељак 10.2. пододељак б) алинеја трећа ове главе).

Титрирати са 0,025 М раствором јода уз индикатор скроба до плаве боје која се задржи од 10 до 15 секунди. Запремину утрошеног јода означити са n.

2) Укупни сумпор диоксид

Додати 8 ml 4 М раствора натријум хидроксида (одељак 10.2. пододељак б) алинеја друга ове главе), промућкати раствор једном и оставити да стоји 5 минута. Мешајући енергично додавати истовремено 10 ml сумпорне киселине 1:10 (v/v) како је описано у одељку 10.2. пододељак б) алинеја трећа ове главе. Одмах титрирати са 0,025 М јода (одељак 10.2. пододељак б) алинеја пета ове главе). Запремину употребљеног раствора јода означити са n‘ (ml).

Додати 20 ml 4 М раствора натријум хидроксида (одељак 10.2. пододељак б) алинеја друга ове главе), промућкати и пустити да одстоји 5 минута. Разредити са 200 ml ледене воде.

Енергично мешајући додати одједном садржај епрувете у којој се налази 30 ml сумпорне киселине 1:10 (v/v). Титрирати слободни сумпор диоксид са 0,025 М раствором јода.

Употребљену запремину раствора јода означити са n‘‘.

г) Исказивање резултата

1) Израчунавање:

(1) Слободни сумпор диоксид у милиграмима по литру:

32 × f × n

где је:

f – корекциони фактор 0,025 М раствора јода;

n – утрошак 0,025 М раствора јода.

(2) Укупни сумпор диоксид у милиграмима по литру:

32 × f × (n + n‘ + n‘‘).

где је:

f – корекциони фактор 0,025 М раствора јода;

n – утрошак 0,025 М раствора јода;

n‘ – утрошак 0,025 М раствора јода;

n‘‘ – утрошак 0,025 М раствора јода.

Напомене:

– За црвена вина са ниским концентрацијама SО2, примерено је користити разређени раствор јода више од 0,025 М (нпр. 0,01 М). У том случају заменити коефицијент 32 са 1,28 у горњој формули.

– За црвена вина препоручује се осветљавање вина одоздо зраком жутог светла из обичне сијалице чији зрак светли кроз раствор калијум-хромата или из лампе са натријумовом паром. Одређивање изводити у тамној соби и посматрати транспарентност вина: у тачки еквиваленције оно постаје опалесцентно.

– Ако је количина сумпор диоксида близу или ако прелази законски дозвољену количину, укупни сумпор диоксид би требало одредити референтном методом.

– Ако се одређивање слободног сумпор диоксида посебно захтева, мора се извести анализа на узорку који је чуван при анаеробним условима на температури од 20°C два дана пре анализе. Одређивање обављати нa 20°C.

– Будући да се неке супстанце оксидишу са јодом у киселој средини, за тачнију анализу мора се та количина јода тачно проценити. Да би се то постигло, слободни сумпор диоксид треба везати на додати етанал или пропанал пре титрације са јодом. У конусну тиквицу од 300 ml сипати 50 ml вина, додати 5 ml раствора етанала, концентрације 7 g/l, или 5 ml пропанала концентрације 10 g/l. Затворити тиквицу и оставити да одстоји најмање 30 минута. Додати 3 ml сумпорне киселине 1:10 (v/v) и довољно 0,025 М раствора јода да се промени боја скроба. Употребљену запремину јода означити са n‘‘ (ml). Ова вредност мора бити одузета од n (слободни сумпор диоксид) и од n + n‘ + n‘‘ (укупни сумпор диоксид). Вредност n‘‘‘ је уопштено мала од 0,2 до 0,3 ml 0,025 М раствора јода. Ако је вину била додата аскорбинска киселина, вредност n‘‘‘ ће бити много виша па је могуће, апроксимативно, мерити количину ове супстанце из вредности n‘‘‘, будући да 1 ml 0,025 М раствора јода оксидише 4,4 mg аскорбинске киселине. Одређивањем n‘‘‘ могуће је сасвим лако утврдити присутност преостале аскорбинске киселине у количинама већим од 20 mg/l у винима којима је она била додата.

XI. ОДРЕЂИВАЊЕ ЛИМУНСКЕ КИСЕЛИНЕ

а) Принцип методе

Лимунска киселина преводи се у оксалацетат и ацетат у реакцији катализованој цитрат-лиазом (CL):

У присуству малат-дехидрогеназе (MDH) и лактат-дехидрогеназе (LDH), оксалацетат и његов продукт декарбоксилације, пируват, редукују се у L-малат и L-лактат помоћу редукованог никотинамид-аденин-динуклеотида (NADH):

Количина NADH оксидованог у NAD+ у овим реакцијама пропорционална је количини почетног цитрата. Оксидација NADH мери се резултирајућим падом апсорбанције на таласној дужини од 340 nm.

б) Апаратура

– Спектрофотометар, који омогућава мерење на 340 nm, таласној дужини на којој NADH има највећу апсорбанцију. Уместо тога може се применити спектрофотометар са дисконтинуираним извором који омогућава мерење на 334 nm или 365 nm. Будући да се спроводе мерења апсолутних апсорбанција (тј. не примењују се калибрационе криве, већ се стандардизација спроводи узимајући у обзир коефицијент екстинкције NADH), морају се проверити скале таласних дужина и спектралне апсорбанције на апарату.

– Стаклене кивете од 1 cm.

– Микропипете за додавање запремине од 0,02 до 2 ml.

в) Реагенси

– Раствор пуфера pH 7,8 (0,51 М раствор глицил глицина; pH 7,8; Zn2+ (0,6 × 10-3 М): 7,13 g глицил глицина растворити у приближно 70 ml редестиловане воде. Подесити pH на 7,8 са приближно 13 ml 5 М раствора натријум хидроксида, додати 10 ml раствора цинк хлорида (80 mg ZnCl2 у 100 ml H2О) и допунити до 100 ml редестилованом водом.

– Раствор редукованог никотинамид-аденин-динуклеотида (NADH) (приближно 6 × 10-3 М): растворити 30 mg NADH и 60 mg NaHCO3 у 6 ml редестиловане воде.

– Раствор малат-дехидрогеназе/лактат-дехидрогеназе (MDH/LDH, 0,5 mg MDH/ml, 2,5 mg LDH/ml): помешати заједно 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml раствора амонијум сулфата (3,2 М) и 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Ова суспензија остаје стабилна најмање једну годину при 4°C.

– Цитрат-лиаза (CL, 5 mg протеин/ml): растворити 168 mg лиофилизата у 1 ml ледене воде. Овај раствор остаје стабилан најмање једану недељу при 4°C или најмање четири недеље ако је смрзнут. Препоручује се пре одређивања проверити активност ензима.

– Поливинилполипиролидон (у даљем тексту: PVPP).

Напомена: сви наведени реагенси су комерцијално доступни.

г) Припрема узорка

Одређивање цитрата се обично спроводи директно у вину без претходног уклањања боје и без разређења уколико је количина лимунске киселине мања од 400 mg/l. Према потреби направити разређење тако да је концентрација цитрата између 20 и 400 mg/l (тј. између 5 и 80 µg цитрата у испитиваном узорку).

Код црвених вина богатих фенолним материјама препоручује се претходна припрема са PVPP:

Направити водену суспензију од око 0,2 g PVPP и оставити да стоји 15 минута. Профилтрирати кроз набрани филтер-папир.

10 ml вина сипати у тиквицу од 50 ml, додати влажни PVPP који је са филтера уклоњен шпатулом. Мућкати неколико мунута и филтрирати.

д) Поступак

На спектрофотометру подесити апсорбанцију на 340 nm, применом кивета ширине 1 cm, уз ваздух као слепу пробу (без кивете на оптичком путу). Затим у кивету стављати како следи:

Промућкати и сачекати да се реакција заврши (око пет минута) и очитати апсорбанције раствора у референтној кивети и кивети за узорак (А2).

Израчунати разлику апсорбанција (А2 – А1) за референтну кивету и кивету за узорак, ΔАR и ΔАS.

На крају, израчунати разлику између ових разлика:

ΔА = ΔАS – ΔАR

Напомена: Време које је потребно да се заврши ензимска реакција може варирати у зависности од шарже. Горња вредност је дата само као оријентација и њу треба одредити за сваку шаржу.

ђ) Исказивање резултата

Концентрација лимунске киселине изражава се у милиграмима по литру на најближи цео број.

1) Израчунавање

Општа формула за израчунавање концентрације у mg/l је:

C = [(V × M)/(e × d × υ)] × ΔА

где је:

V = запремина раствора који се анализира у ml (3,14 ml);

υ = запремина узорка у ml (0,2 ml);

М = молекулска маса једињења које одређујемо (за безводну лимунску киселину М =192,1);

d = оптички пут у кивети у cm (1 cm);

e = коефицијент апсорбанције NADH (код 340 nm, е = 6,3 mmol-1 ×1 × cm-1), тако да је:

C = 479 × ΔА.

Ако је узорак претходно разређен резултат помножити с фактором разређења.

Напомена:

Код 334 nm: C = 488 x ΔА (ε = 6,2 mmol-1 × 1 × cm-1); код 365 nm: C = 887 x ΔА (ε = 3,4 mmol-1 × 1 × cm -1)

2) Поновљивост (r)

За концентрације лимунске киселине мање од 400 mg/l: r = 14 mg/l.

За концентрације лимунске киселине веће од 400 mg/l: r = 28 mg/l.

3) Репродуктивност (R)

За концентрације лимунске киселине мање од 400 mg/l; R = 39 mg/l.

За концентрације лимунске киселине веће од 400 mg/l; R = 65 mg/l.

XII. ОДРЕЂИВАЊЕ УГЉЕН ДИОКСИДА

Принцип методе

12.1. Референтна метода:

а) Мирна вина (притисак CО2 < 0,5 × 105 Pa; 105 паскала (Pa) = 1 bar):

Запремину вина узету од узорка охладити на око 0°C и помешати са довољном количином натријум хидроксида да се добије pH вредност од 10 до 11. Титрација се спроводи раствором киселине у присуству угљене-анхидразе. Садржај угљен диоксида израчунава се из утрошка киселине потребне да се pH промени од 8,6 (хидрогенкарбонатни облик) до 4,0 (угљена киселина). Слепа проба се обавља у истим условима на дегазираном вину да би се узела у обзир запремина раствора натријум хидроксида који веже киселине у вину.

б) Пенушава и газирана вина:

Узорак вина који се анализира охлади се близу тачке смрзавања. Након узимања количине која ће се употребити за слепу пробу након дегазирања, остатак у боци се преведе у алкално стање тако да се сав угљен диоксид веже у облику Na2CО3. Затим се спроводи титрација раствором киселине у присуству угљене-анхидразе. Садржај угљен диоксида израчунава се из утрошка киселине потребног да се pH промени од 8,6 (хидрогенкарбонатни облик) до 4,0 (угљена киселина). Слепа проба се врши у истим условима на дегазираном вину да би се узела у обзир запремина раствора натријум хидроксида који веже киселине у вину.

12.2. Уобичајена метода:

а) Пенушава и газирана вина

Манометарска метода: надпритисак угљен диоксида мери се директно у боци помоћу афрометра.

12.1. РЕФЕРЕНТНА МЕТОДА

а) Мирна вина (притисак CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa)

1) Апаратура

– Магнетна мешалица;

– pH метар.

2) Реагенси

– Раствор натријум хидроксида (NaOH) 0,1 М;

– раствор сумпорне киселине (H2SО4) 0,05 М;

– раствор ензима угљене-анхидразе, 1 g/l.

3) Поступак:

Узорак вина охладити на приближно 0°C заједно с пипетом од 10 ml за одмеравање. Ставити 25 ml 0,1 М раствора натријум хидроксида (одељак 12.1. пододељак а) тачка 2) алинеја прва ове главе) у чашу од 100 ml; додати две капи воденог раствора угљене-анхидразе (одељак 12.1. пододељак а) тачка 2) алинеја трећа ове главе). Додати 10 ml вина помоћу пипете охлађене на 0°C.

Ставити чашу на магнетну мешалицу, наместити pH електроду и повремено мешати. Кад течност постигне собну температуру, полако титрирати 0,05 М раствором сумпорне киселине (одељак 12.1. пододељак а) тачка 2) алинеја друга ове главе) до pH 8,6. Забележити утрошак на бирети.

Наставити титрацију сумпорном киселином до pH 4,0. Означити са n ml утрошене сумпорне киселине за титрацију између pH 8,6 и 4,0.

Уклонити СО2 из око 50 ml узорка вина мућкањем у вакууму око три минута, уз грејање тиквице у воденом купатилу на око 25°C.

Горњи поступак поновити и на 10 ml дегазираном вину. n‘ (ml) је утрошак 0,05 М сумпорне киселине.

4) Исказивање резултата

1 ml 0,05 M раствора сумпорне киселине одговара 4,4 mg CО2. Количина CО2 у грамима по литру (g/l) дата је формулом:

0,44 × f × (n – n‘)

где је:

f – корекциони фактор 0,05 М раствора сумпорне киселине;

n – утрошак 0,05 М раствора сумпорне киселине у расхлађеном вину са додатком 25 ml 0,1 М натријум хидроксида;

n‘ – утрошак 0,05 М раствора сумпорне киселине у дегазираном вину.

Изражава се на два децимална места.

Напомена: Ако вино садржи мало CО2 (CО2 < 1 g/l) није потребно додати угљену-анхидразу за катализу реакције хидратације CО2.

б) Пенушава и газирана вина

1) Апаратура:

– Магнетна мешалица;

– pH метар.

2) Реагенси:

– Раствор натријум хидроксида (NaOH), 50 % (m/m);

– раствор сумпорне киселине (H2SО4), 0,05 М;

– раствор ензима угљене-анхидразе, 1 g/l.

3) Поступак:

Означити ниво вина у боци па га хладити док не почне смрзавање. Пустити да се боца благо угреје, промућкати је док кристали леда не нестану. Брзо уклонити чеп и ставити 45 до 50 ml вина у одмерни цилиндар за слепу пробу. Тачну запремину узетог вина, v (ml), очитати на цилиндру кад вино постигне собну температуру.

Одмах након што је уклоњен узорак за слепу пробу, додати 20 ml раствора натријум хидроксида (одељак 12.1. пододељак б) тачка 2) алинеја прва ове главе) у боцу запремине 750 ml.

Причекати да вино постигне собну температуру.

У чашу од 100 ml ставити 30 ml прокуване дестиловане воде и две капи раствора угљене-анхидразе (одељак 12.1. пододељак б) тачка 2) алинеја трећа ове главе). Додати 10 ml вина које је претходно преведено у алкалну средину. Ставити чашу на магнетну мешалицу, наместити електроду и магнетни штапић уз умерено мешање.

Титрирати раствором сумпорне киселине (одељак 12.1. пододељак б) тачка 2) алинеја друга ове главе) до pH 8,6. Забележи се утрошак на бирети. Наставити полако титрацију сумпорном киселином до pH 4,0. Нека је n (ml) утрошак киселине за титрирање између pH 8,6 и 4,0. Уклонити CО2 из v (ml) узорка вина (које је узето за слепу пробу) мућкањем у вакууму око три минута, уз грејање тиквице у воденом купатилу на око 25°C. Узети 10 ml дегазираног вина и додати 30 ml прокуване дестиловане воде, додати две до три капи раствора натријум хидроксида да се pH подеси на између 10 и 11. Затим следити горњи поступак. Нека је n‘ (ml) додата запремина 0,05 М раствора сумпорне киселине.

4) Исказивање резултата

1 ml 0,05 М раствора сумпорне киселине одговара 4,4 mg CО2. Испразнити боцу вина које је било преведено у алкалну средину и одредити унутар 1 ml почетну запремину вина тако да се боца испуни водом до ознаке, и то је V (ml).

Количина CО2 у грамима по литру (g/l) дата је формулом:

0,44 × f × (n – n‘) × [ (V - n + 20)/ (V - n)]

где је:

f – корекциони фактор 0,05 М раствора сумпорне киселине;

n – утрошак 0,05 М раствора сумпорне киселине у расхлађеном вину са додатком 25 ml 0,1 М натријум хидроксида;

n‘ – утрошак 0,05 М раствора сумпорне киселине у дегазираном вину.

Резултат се изражава на два децимална места.

Надпритисак на 20°C (Paph20) изражен у Паскалима и дат је формулом:

где је:

Q = количина CO2 у g/l вина;

А = алкохолна јачина вина на 20°C;

S = количина шећера у вину у g/l;

Patm = атмосферски притисак у Паскалима.

12.2. УОБИЧАЈЕНА МЕТОДА

а) Пенушава и газирана вина

1) Апаратура:

Афрометар:

Афрометар је уређај за мерење притиска у боцама пенушавих и газираних вина. Има разних модела у зависности од начина затварања боце. Скала афрометра је у Паскалима (Pa), иако је практичније користити 105 Pa или килопаскал (kPa).

Афрометри могу имати различите класе манометара. Класа манометра је прецизност очитавања у односу на целу скалу изражена у процентима (нпр. манометар од 1000 kPa класе 1 значи да се максимални притисак од 1000 kPa може очитати унутар ± 10 kPa). Уређај класе 1 препоручује се за прецизна мерења. Афрометри морају бити редовно проверавани (барем једном годишње).

2) Поступак

Мерења се морају вршити на боцама чија се температура стабилизовала најмање 24 сата. Након што је чеп пробушен, боца се мора јако промућкати све док притисак на постане константан, тада се очита.

3) Исказивање резултата

Притисак на 20°C (Paph20) изражава се у Паскалима (Pa) или килопаскалима (kPa).

Резултат би требало да се изрази у облику који је у складу са прецизношћу манометра (нпр. 6,3 x 105 Pa или 630 kPa, а не 6,33 x 105 Pa или 633 kPa за манометар класе 1 са пуном скалом до 1000 kPa).

Ако је температура на којој је изведено мерење различита од 20°C мора се урадити корекција множењем измерене вредности притиска са коефицијентом:

Paph20 / Paph t

датим у табели 14. овог прилога. На тај начин добија се резултат на 20°C.

12.3. ОДНОС ИЗМЕЂУ ПРИТИСКА И КОЛИЧИНЕ УГЉЕН ДИОКСИДА У ГАЗИРАНОМ ВИНУ

Из притиска на 20°C (Paph20) израчуна се апсолутни притисак на 20°C (Pabs20) помоћу формуле:

Pabs20 = Patm + Paph20

где је Patm атмосферски притисак изражен у барима.

Количина угљен диоксида у вину дата је следећим односима:

– у литрама CО2 по литру вина:

0,987 × 10-5 × Pabs20 × (0,86 – 0,01 А) × (1 – 0,00144 S);

– у грамима CO2 по литру вина:

1,951 × 10-5 x Pabs20 × (0,86 – 0,01 А) × (1 – 0,00144 S)

где је:

А – алкохолна јачина вина на 20°C;

S – количина шећера у g/l.

XIII. ОДРЕЂИВАЊЕ ШЕЋЕРА РЕФРАКТОМЕТРОМ

а) Принцип методе

Индекс рефракције на 20°C, изражен као апсолутна вредност или као масени проценат сахарозе, приказан је у табелама 16. и 17. овог прилога, помоћу кога се добија концентрација шећера у грамима по литру и грамима по килограму шире, концентроване шире и ректификоване концентроване шире.

б) Апаратура

Abbe-ов рефрактометар који мора имати скале у:

– масеним процентима сахарозе са поделом од 0,1%;

– или у индексима рефракције на четири децимална места.

Рефрактометар мора имати термометар са скалом најмање од +15°C до +25°C са омогућеном циркулацијом воде која осигурава мерење при температури 20°C ± 5°C. Упутство за употребу апарата мора садржати тачне инструкције, посебно у вези калибрације и извора светлости.

в) Припрема узорка

– Шира и концентрована шира:

По потреби, шира се пропусти кроз четвороструко пресавијену суву газу и након одбацивања првих капи филтрата, наставља се одређивање филтрираног производа.

– Ректификована концентрована шира

У зависности од концентрације, користи се или ректификована концентрована шира или раствор добијен тако што се 200 g ректификоване концентроване шире разблажи са водом до 500 g, при чему сва мерења морају бити тачно спроведена.

г) Поступак:

Узорак темперирати на близу 20°C. Ставити малу количину узорка на доњу призму рефрактометра, при чему треба пазити (јер су призме чврсто причвршћене једна на другу) да узорак једнако покрива стаклену површину призме. Мерење извршити у складу са упутствима за употребу апарата.

Очитати масени проценат сахарозе унутар 0,1 % или индекс рефракције на четири децимална места. На истом узорку направити најмање два одређивања. Забележити температуру t°C.

д) Исказивање резултата

1) Корекција температуре

– Инструменти са скалом у масеним процентима сахарозе: корекцију температуре извршити уз помоћ табеле 15. овог прилога .

– Инструменти са скалом у индексима рефракције: индекс рефракције измерен на t°C пронаћи у табели 16. овог прилога, да се добије (колона I) одговарајућа вредност у масеним процентима сахарозе на t°C. Ова вредност је коригована за температуру и изражена као концентрација на 20°C користећи табелу 15. овог прилога.

2) Концентрација шећера у шири и концентрованој шири:

Одредити масени проценат сахарозе на 20°C у табели 16. овог прилога и из истог реда очитати концентрацију шећера у грамима по литру и грамима по килограму. Концентрација шећера изражена је као инвертни шећер на једно децимално место.

3) Концентрација шећера у ректификованој концентрованој шири

Одредити масени проценат сахарозе на 20°C у табели 17. овог прилога и из истог реда очитати концентрацију шећера у грамима по литру и грамима по килограму. Концентрација шећера изражена је као инвертни шећер на једно децимално место.

Ако се мерење врши на разређеној ректификованој концентрованој шири, резултат се множи са фактором разређења.

4) Индекс рефракције шире, концентроване шире и ректификоване концентроване шире

Одредити масени проценат сахарозе на 20°C у табели 16. или 17. овог прилога и из истог реда прочитати индекс рефракције на 20°C на четири децимална места.

XIV. МЕТОДА СЕНЗОРНОГ ОЦЕЊИВАЊА ВИНА

Сензорне особине вина оцењују се сензорним методама.

За оцењивање сензорних особина вина користи се метода позитивних бодова (систем од 0 до 100) тако да:

1) „стоно” вино (вино без географског порекла) и увозно вино – морају да имају најмање 39,00 бодова;

2) регионално вино – најмање 59,00 бодова;

3) квалитетно вино са контролисаним географским пореклом – најмање 79,00 бодова;

4) врхунско вино са контролисаним и гарантованим географским пореклом и квалитетом – најмање 89,00 бодова.

Сензорне особине вина које се вреднују бодовима од 0 до 10 (0 – неприхватљиво, 4 – лош квалитет, 5 – прихватљиво, 6 – просечно, 7 – уобичајено, 8 – добро, 9 – врло добро, 10 – одлично) јесу:

1) визуелни опажаји:

(1) боја,

(2) бистрина;

2) олфактивни опажаји:

(1) чистоћа,

(2) финоћа,

(3) интезитет;

3) густативни опажаји:

(1) чистоћа,

(2) структура, тело, алкохол,

(3) хармонија, равнотежа, интезитет;

4) густативно-олфактивни опажаји:

(1) одрживост,

(2) карактеристике за одговарајућу ознаку за вина са географским пореклом и подударност са врстом, типом вина или карактеристикама сорте.

ПРИЛОГ 2

ДРУГЕ МЕТОДЕ АНАЛИЗЕ

1. ОДРЕЂИВАЊЕ ХЛОРИДА
(Табела 1 - Методе анализе за испитивање параметара квалитета шире, вина и других производа (у даљем тексту: Табела 1), редни број 5, референца број 2)

а) Употребљива метода

Реагенси:

1) Засићени раствор КМnO4 ( ~ 6,5%) ;

2) 2 N азотна киселина (HNO3);

3) 0,1 N сребро нитрат (AgNO3);

4) 0,1 N калијум тиоцијанат (KSCN);

5) фериамонијум сулфат (15 g у 100 ml) или гвожђе нитрат (Fe(NO3)3) (10 g у 100 ml);

6) раствор баријум хидроксида Ba(OH)2 (50 g у 1000 ml – скоро засићен);

7) водоник пероксид (H2O2);

8) диетил - етар.

Поступак:

У нормални суд од 200 ml дода се 100 ml претходно неутралисаног вина са раствором Ba(OH)2, у присуству фенолфталеина и допуни дестилованом водом до црте. После мешања узорак се филтрира кроз наборани филтер папир (филтер је испран млаком водом). У ерленмајер од 500 ml дода се 100 ml филтрата, 20 ml 2 N HNO3 и 5 ml засићеног раствора КМnO4, промућка и остави да одстоји док не исчезне љубичаста боја. Уколико боја остане додаје се неколико капи раствора водоник пероксида (H2O2) док љубичасто обојење не исчезне. Безбојном филтрату додати 10 ml 10% гвожђе нитрата, 20 ml диетил-етра и 10 ml 0,1 N раствора AgNO3 (ове количине су довољне ако испитивани узорак садржи мање од 1 g/l NaCl). Вишак AgNO3 одређује се са 0,1 N калијум тиоцијанатом. Завршна тачка титрације се постиже када слабо цигласто црвена боја буде постојана 5 секунди. Утрошени милилитри су једнаки n.

Израчунавање:

1) Количина хлорида у милиеквивалентима по литру вина (meq/l) добија се следећом формулом:

2 × f × (10 – n)

где је:

f – корекциони фактор 0,1 N раствора калијум тиоцијаната;

n – утрошак у ml 0,1 N раствора калијум тиоцијаната.

2) Количина хлорида у грамима NaCl по литру вина (g/l) добија се следећом формулом:

0,1169 × f × (10 – n)

где је:

f – корекциони фактор 0,1 N раствора калијум тиоцијаната;

n – утрошак у ml 0,1 N раствора калијум тиоцијаната.

2. ОДРЕЂИВАЊЕ СУЛФАТА
(Табела 1, редни број 6, референца бр. 2. и 3)

Призната метода

а) Референтна метода

Таложи се као баријум сулфат и гравиметријски се одређује. Вино се претходно ослобађа сумпорасте киселине загревањем без присуства ваздуха.

б) Употребљива метода

Таложи се као олово сулфат и комплексометријски одређује.

а) Референтна метода:

Реагенси:

– 2 N раствор HCl;

– раствор BaCl2: растворити 100 g BaCl2 × 2H2O у 1000 ml дестиловане воде.

Поступак:

Након дестилације укупне сумпорасте киселине која остаје у тиквици, остатак од 100 ml вина се закисели са 5 ml 2 N HCl. Течност се квантитативно преноси у чашу од 500 ml и тиквица се испира са истом количином воде, тако да укупна запремина износи 200 ml. Затим се дода 5 ml 2 N HCl, и течност загрева до кључања и дода у капима 10 ml раствора BaCl2. Настави се са загревањем на температури од 60ºС или 2 сата на кључалом воденом купатилу до потпуног таложења BaSO4. Код мањих количина BaSO4 талог се оставља да се исталожи на хладном преко ноћи, а затим се филтрира кроз филтер папир који не оставља пепео, талог се испира, а затим се суши са филтером и спали у пећници за жарење, охлади у ексикатору до константне масе, и одмах затим мери.

Израчунавање:

1) Количина сулфата у милиеквивалентима по литру вина (meq/l) добија се следећом формулом:

85,68 × m

где је:

m – измерена количина BaSO4 у mg.

2) Количина сулфата у грамима K2SO4 по литру вина (g/l) добија се следећом формулом:

7,465 × m

где је:

m – измерена количина BaSO4 у mg.

б) Употребљива метода:

Реагенси:

1) HNO3, концентрована 65% (d = 1,40);

2) реагенс за таложење: растворити 25 g PbNO3 у 100 ml дестиловане воде и додати 1,5 ml концентровану HNO3;

3) течност за прање: исти делови разблажене HNO3 (5 ml концентроване HNO3 у 100 ml дестиловане воде) и 96 % vol етанол се помешају непосредно пре употребе;

4) раствор комплексона III: 0,1 М динатријум етилен диамин тетра сирћетне киселине (растворити 37,22 g ди-натријумове соли дихидрата етилен диамин тетра сирћетне киселине у 1000 ml дестиловане воде);

5) раствор пуфера: 54 g амонијум хлорида и 350 ml концентрованог амонијака (25%) допуни се дестилованом водом до 1000 ml;

6) индикатор: иситнити до праха у авану ериохром црно Т и NaCl у односу 1:500;

7) 0,1 М раствор ZnCl2: раствори се 13,7 g безводног ZnCl2 , уз додатак од неколико капи HCl, са дестилованом водом до 1000 ml.

Поступак:

25 ml вина се сипа у кивету за центрифугу и подеси се са неколико милилитара етанола (96 % vol) на алкохолну јачину од приближно 20 % vol и затим дода 0,6 ml концентроване HNO3 и 1 ml реагенса за таложење (1 ml PbNO3 одговара количини од 5 g K2SO4 у 1 литру вина). Након додавања реагенса за таложење, кивету добро промућкати и оставити најмање 30 минута како би се издвојио талог PbSO4. Након 30 минута, узорак се центрифугира, супернант се одлије, а талог се испере са течношћу за прање и поново центрифугира (овај корак поновити два пута). Након испирања и центрифугирања талог се квантитативно, уз коришћење стакленог штапића са гумом на врху и 50 ml дестиловане воде, преноси у ерленмајер у коме се налази 5 ml раствора комплексона III. После додатка 2 ml раствора пуфера и додатка неколико кристала индикатора врши се титрација са 0,1 М раствором ZnCl2 до промене боје из плаве у винско црвену.

Израчунавање:

1) Количина сулфата у милиеквивалентима по литру вина (meq/l) добија се следећом формулом:

2 × f × (10 – n)

где је:

f – корекциони фактор 0,1 M раствора ZnCl2;

n – утрошак у ml 0,1 M раствора ZnCl2.

2) Количина сулфата у грамима K2SO4 по литру вина (g/l) добија се следећом формулом:

0,697 × f × (5,00 – n)

где је:

f – корекциони фактор 0,1 M раствора ZnCl2;

n – утрошак у ml 0,1 M раствора ZnCl2.

3. ОДРЕЂИВАЊЕ ЛИМУНСКЕ КИСЕЛИНЕ
(Табела 1, редни број 12, референца број 2)

а) Употребљива метода

Принцип методе:

Метода се заснива на трансформацији лимунске киселине до пента-бром-ацетона, његовим екстраховањем са хлороформом, па третирањем са раствором цијанида и реагенсом пиридин-барбитурном киселином.

Реагенси:

1) Сумпорна киселина (1:10);

2) мета фосфорна киселина 40% раствор;

3) калијум бромид KBr 12% раствор;

4) калијум перманганат KМnO4 5% раствор;

5) водоник пероксид H2O2 3% раствор;

6) хлороформ CHCl3 p.a;

7) калијум цијанид KCN 1% раствор;

8) мешани реагенс пиридин-барбитурна киселина.

Прибор:

1) Пипете од 1, 2, 5 и 10 ml;

2) епрувете;

3) епрувете са шлифованим чепом;

4) левак за одвајање од 100 ml;

5) UV – VIS спектрофотометар;

6) хронометар.

Норматив по једној анализи износи: 1 ml сумпорне киселине (1:10), 0,24 ml 40 % мета фосфорне киселине, 0,25 ml 12% калијум бромида, 2 ml 5% калијум перманганата, неколико капи 3% водоник пероксида, 5 ml хлороформа p.a, 3 ml 1% калијум цијанида, 1 ml мешаног реагенса и око 100 ml деминерализоване воде.

Припрема реагенса:

Сви горе наведени реагенси се припремају у виду одговарајућих водених раствора.

Припрема мешаног реагенса: одмерити 3 g барбитурне киселине и растворити је у чаши од 100 ml са 15 ml загрејане деминерализоване воде. Затим додати 15 ml пиридина, промешати и додати још 3 ml концентроване хлороводоничне киселине (HCl). Све квантитативно пренети у нормални суд од 50 ml и допунити до црте деминерализованом водом. Растварање и мешање ових хемикалија обавезно радити у дигестору. Потребно је реагенс чешће правити, јер се стајањем мења и постаје загасито жут.

Припрема узорка:

Код пенушавих вина одстранити угљен диоксид.

Поступак:

У нормални суд од 100 ml одмерити 10 ml вина и допунити дестилованом водом до црте. Одатле узети аликвот од 5 ml, сипати у левак за одвајање па додати још 1 ml (1:10) сумпорне киселине, 0,24 ml 40% мета фосфорне киселине, 0,25 ml 12% калијум бромида, 2 ml 5% калијум перманганата и потом промућкати 15 минута. Након завршетка оксидације, уклонити вишак калијум перманганата додавањем 3% раствора водоник пероксида све док раствор не постане безбојан. После обезбојавања у левак се додаје 5 ml хлороформа и енергично промућка. У епрувету се потом испусти доњи хлороформни слој 4,5 ml и одатле одпипетира 1 ml у епрувету са шлифом, којој се дода још 3 ml 1% калијум цијанида. Епрувета се затвори и енергично промућка, те након тога раствору дода 1 ml мешаног реагенса пиридин-барбитурне киселине и све поново промеша и остави да одстоји 15 минута. Након стајања, раствору додати 6 ml дестиловане воде, затворити и промешати. За очитавање на спектрофотометру узети горњи бистри слој. Очитавање се обавља на таласној дужини од 584 nm.

Oчитавање узорка би требало обавити у временском периоду између 20 и 30 минута по додавању реагенса (пиридин-барбитурна киселина). Уз анализу вина обавезно је да се на исти начин третира и контролна проба (5,0 ml дестиловане воде уз додавање свих реагенаса) и да се очитавање анализираног узорка врши у односу на контролну пробу. Контролна проба је безбојна или светло жућкасто обојена, што не утиче на очитавање пурпурне боје узорка.

Ако узорак вина садржи већу количину лимунске киселине, узима се мања количина хлороформног екстракта (нпр. 0,5 + 0,5 ml чистог хлороформа), а добијени резултати се множе са 2.

Припрема калибрационе криве:

Матични раствор:

Одмерити 0,1094 g лимунске киселине (C6H8O7 × H2O), растворити и квантитативно пренети у нормални суд од 100 ml. Допунити до црте дестилованом водом, затворити и добро промешати. 1 ml матичног раствора садржи 1 mg лимунске киселине (безводне).

Припремити 5 нормалних судова од 100 ml и обележити их са бројевима од 1 до 5 и од матичног раствора одмерити пипетом следеће количине: 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 и 7,5 ml и допунити их дестилованом водом до 100 ml.

На овај начин припремљени радни стандарди одговарају следећим концентрацијама лимунске киселине: 50, 100, 250, 500 и 750 mg/l.

Од припремљених радних стандарда одпипетирати по 5,0 ml сваког стандарда у појединачно одговарајуће левкове за издвајање и затим додати реагенсе у истим количинама и истим редом, како је то претходно описано код анализе испитиваног узорка вина. При установљавању калибрационе криве обавезно укључити и контролну пробу као што је то учињено и код узорка вина. Највећа концентрација лимунске киселине не би требало да пређе 750 mg/l, јер се до те границе обојени раствор влада по закону Ламбер-Бера.

Израчунавање:

Укупна количина лимунске киселине изражава се у mg/l према следећој формули:

C = A × F

где је:

А – очитана апсорбанција;

F – 394,56 фактор добијен из калибрационе криве из односа С/А (видети часопис Југословенско виноградарство и винарство 2 – 3 1986).

Изражавање резултата:

Резултат се изражава на две децимале (0,00) у mg/l.

4. ОДРЕЂИВАЊЕ КАЛИЈУМА
(Табела 1, редни број 16, референца бр. 4. и 5)

У 100 ml дестиловане воде дода се 2 ml 10% H2SO4 и у сваки узорак се додаје и сипа у нормалне судове од 25 ml.

Реагенси:

1) Калигност: 3 g калигноста се раствори и допуни до 100 ml и дода неколико стотих делова грама алуминијум оксида (неутралног);

2) засићени водени раствор бром крезол-зеленог;

3) 10% сумпорне киселине (H2SO4);

4) 1 N натријум ходроксид (NaOH).

Поступак:

25 ml вина се ижари у пећници за жарење на температури од 525 (± 25 ºС). Пепео мора бити потпуно бео. Добијени пепео се раствара са 20 ml дестиловане воде у коју је додато 0,5 ml 10% H2SO4, растварање се понови 2 до 3 пута уз испирање и затим квантитативно пренесе у нормални суд од 25 ml и допуни дестилованом водом до црте. Раствор се добро промућка и филтрира (црвена или плава трака). 10 ml филтрата се пренесе у ерленмајер од 100 ml и дода 1 кап индикатора бром-крезол-зеленог и толико 1 N NaOH док се не постигне pH вредност у опсегу од 4 до 5 (појава светло зелене боје). Потом се садржај загреје на 50ºС на воденом купатилу уз мућкање и константно додавање у капима 5 ml 3% раствора калигноста. После хлађења бели талог се филтрира преко B-4 филтера, а затим се талог испира водом којој је додат калигност (2 ml 3% калигноста додаје са на 100 ml воде). Бели талог се поново филтрира преко B-4 филтера, а затим суши у сушници на 110ºС у времену од 1 сата до константне масе и мери. Након мерења талог се испира 3 пута са ацетоном (талог на гучу). Гуч се опет суши и мери на аналитичкој ваги. Разлика између два мерења даје масу тетра фенил калијума (p је маса талога).

Израчунавање:

Количина калијума изражава се у грамима по литру и добија се следећом формулом:

10,91 × p

где је:

p – маса талога.

5. ОДРЕЂИВАЊЕ ГВОЖЂА
(Табела 1, редни број 19, референца број 4)

а) Одређивање гвожђа колориметријски - употребљива метода

Принцип:

Гвожђе редуковано са хидроксиламин-хидрохлоридом реагује са орто-фенантролином који је додат вину. Интензитет настале боје мери се на таласној дужини од 508 nm. Количина гвожђа се очитава из претходно направљене калибрационе криве.

У случају интензивно обојених црвених вина користи се метода одређивања гвожђа из пепела.

Реагенси:

Раствор 1:

– HCl концентрована (d = 1,19) 170 ml;

– хидроксиламин-хидрохлорид 10 g;

– дестилована вода до 1000 ml.

Раствор 2:

– O-фенантролин 1 g;

– дестилована вода до 100 ml.

Један грам (1 g) О-фенантролина у 80 ml дестиловане воде загрејaти на 80°C и додати концентровану HCl само толико да се о-фенантролин раствори.

Раствор 3:

– Амонијум ацетат 180 g;

– дестилована вода до 1000 ml.

Напомена: Трагови гвожђа у води или у реагенсима не утичу на тачност резултата анализе. Насупрот раствору хидрохинона, раствор хидроксиламин-хидрохлорида је одржив у току више месеци.

Поступак:

У два нормална суда од 50 ml дода се 10 ml вина и 10 ml раствора 1. У један од ових нормалних судова дода се још и 1 ml раствора 2. После 10 минута дода се у оба нормална суда 10 ml раствора 3. Док се слепа проба не мења или слабо поприма сиву боју, раствор у мерном суду коме је додат раствор 2 поприма одмах цревену-оранж боју. Судови се допуне дестилованом водом до црте и врши се одређивање интензитета боје течности у односу на слепу пробу на таласној дужини од 508 nm. Количина гвожђа у mg по 1 литру вина очитава се из калибрационе криве која се припрема на следећи начин.

Припрема калибрационе криве:

Један грам (1 g) гвоздених опиљака раствори се на топлом у 250 ml 20% H2SO4 (спречити губитак прскањем). После хлађења раствор се допуњава до 1 литар и представља матични раствор.

Матични раствор се такође може припремити коришћењем Морове соли познатог састава. За Морову со (чистоће 100%) важи следећи однос: 1 g = 7,018 g гвожђа Морове соли (мерено на ваздуху).

Узети 20 ml матичног раствора и допунити дестилованом водом до 1 литра. 1 ml разблажења садржи 0,02 mg гвожђа. Калибрациона крива се конструише тако да се садржај гвожђа креће од 2 до 20 mg/l. У том смислу додаје се у нормалним судовима од 50 ml од 1 до 10 ml разблажења, 10 ml раствора 1 и 1 ml раствора 2. После 10 минута у нормалне судове дода се по 10 ml раствора 3 и нормални судови се допуне дестилованом водом до црте. Мерење се обавља у односу на слепу пробу, која се припрема мешањем 10 ml раствора 1 и 10 ml раствора 3, а затим допуни дестилованом водом до 50 ml (слепа проба не садржи раствор 2). На основу добијених вредности конструише се калибрациона крива која представља праву линију. Садржај гвожђа се изражава у mg/l.

Корекција калибрационе криве:

Може се десити, да упркос коректном начину рада добијене вредности не леже на правој. Разлог за то може бити недовољна осетљивост фотометра. У таквим случајевима не треба вршити даља мерења, већ се примењују добијене вредности за обрачун методом најмањег квадрата вероватних вредности константе А и k према једначини:

Y = log y = A – kx

где y представља трансмисију у %, a x cадржај гвожђа у mg/l. Потом се обрачунавају вредности Y1 и Y2 које одговарају произвољно бираним вредностима x1 и x2.

Основни приказ: к1 = 0 и к2 = 10.

Kaлибрациона крива се прави тако што се на милиметарском папиру кроз координатне тачке (x1, Y1) и (x2, Y2) повлачи права. Права пролази кроз нулту тачку само уколико примењени реагенси не садрже гвожђе.

Специјални случајеви:

Вина са високим садржајем гвожђа

Препоручљива је, али не безусловно потребна, примена кивета различитих дебљина, при којима је одређена калибрациона крива конструисана. Мора се узети у обзир чињеница да Ламбер-Беров закон важи само за вредности у опсегу од 20 до 200 μg (у 50 ml). Уколико је обојење јако, поновити oдређивање са већим разблажењем (најповољније вредности за трансмисију једног одређивања налазе се између 30% и 70%, што одговара екстинкцијама између 0,15 и 0,5). Садржаји оба нормална суда могу такође бити разблажени раствором нпр. 1 : 2 или 1 : 5 који се добија мешањем следећих раствора:

Раствор 1 ................................ 1 део

Раствор 3 ................................ 1 део

Дестилована вода .................. 3 дела.

Јако oбојена црвена вина

Код јако обојених црвених вина метода постаје неосетљива, мада теоретски, тачност остаје непромењена. Интензитет светлости која се од стране гвожђе-II-фенантролина апсорбује представља само један мали део укупне апсорпције тако да резултати бивају непоуздани. У том случају се препоручује испитивање са малом количином вина или анализу обавити на пепелу. По доле описаним условима спроведена анализа не би требало да условљава губитке за више од 5%.

б) Одређивање гвожђа из пепела

У платинској шољи промера 8 cm отпипетира се 10 ml вина и на воденом купатилу упари дo сувог и осуши у сушници на 110°C до 120°C. Да би се спречило топљење пепела жарење се врши преко малог пламена или у пећи за жарење. У случају потребе влажити пепео водом, сушити и поново жарити. После хлађења растворити пепео лаганим влажењем у 10 ml раствора 1 и оставити шољу неколико минута на воденом купатилу. После 3 до 5 минута пренети раствор у нормални суд од 50 ml, испрати шољу 3 пута са 2 до 5 ml воде и додати воду раствору. После хлађења дода се 1 ml раствора 2. После 15 минута дода се 10 ml раствора 3, допуни дестилованом водом до црте и врши одређивање на горе описан начин. Припреми се такође и слепа проба. Мерење се обавља у односу на слепу пробу која се припрема мешањем 10 ml раствора 1 и 10 ml раствора 3, а затим допуни дестилованом водом до 50 ml (слепа проба не садржи раствор 2).

6. ОДРЕЂИВАЊЕ УКУПНОГ ФОСФОРА КАО P2O5
(Табела 1, редни број 32, референца број 2)

Реагенси:

1) Перхлорна киселина 60% p.a;

2) HNO3 65 % p.a;

3) концентрована H2SO4 p.a;

4) раствор молибдат-ванадатa: 20 g амонијум-молибдата p.a. растворити у 400 ml дестиловане воде температуре од 50ºС и охладити. 1 g амонијум-ванадата p.a. растворити у 300 ml кључале дестиловане воде и након хлађења уз мешање додати 140 ml HNO3 65% p.a. Раствор молибдата уз мешање и у малим порцијама додати раствору ванадата и мешавину допунити дестилованом водом до 1000 ml;

5) калијум хидроген фосфат (KH2PO4 p.a.) сушити у сушници два сата на 105ºС, па охладити у ексикатору.

Поступак:

Сагоревање (а):

2 ml испитиване течности отпипетирати у епрувету и додати неколико перли (узорке који садрже алкохол претходно упарити на половину – на 1 ml). Затим додати 1 ml перхлорне киселине и 1,5 ml HNO3 (65% p.a.) и опрезно загревати на пламенику (пешчаном купатилу). Када почне да угљенише додати поново 0,5 ml HNO3 (65% p.a.) и загревање наставити док се не добије потпуно бистар и безводан раствор. Упарити на 0,5 ml. Након хлађења раствор се са 30 ml дестиловане воде квантитативно пренесе у нормални суд од 50 ml. Припремити слепу пробу на исти начин са 1 ml перхлорне киселине и 1,5 ml HNO3 (65% p.a.).

Мерење (б):

Раствору у нормалном суду од 50 ml додати 10 ml раствора молибдат-ванадата, допунити дестилованом водом до црте и добро промућкати. Оставити да стоји 10 минута. Слепу пробу (б) припремити допуњавањем 10 ml раствора молибдат-ванадата и допунити дестилованом водом до 50 ml. Екстинкција узорка (а) на 400 nm мери се у односу на слепу пробу (б).

Калибрациона крива (в):

Основни раствор садржи 1000 mg фосфора по 1 литру, растварањем 4,3937 g осушеног калијум хидроген фосфата у дестилованој води додавањем концентроване H2SO4 и допуњавањем дестилованом водом до 1000 ml. Узети 10 ml од овог раствора и разблажити до 500 ml, а затим од овога раствора узимати 5, 10, 15, 20, 25 ml и пренети у нормалне судове од 50 ml, додати по 10 ml раствора молибдат-ванадата и допунити дестилованом водом до црте. Припремљене растворе оставити да одстоје 10 минута. Припремљени раствори имају концентрације фосфора: 2, 4, 6, 8 и 10 μg / ml. Измерити екстинкције ових раствора у односу на слепу пробу (б) и формирати калибрациону криву. Садржај фосфора се очитава из калибрационе криве. Добијeна вредност у μg фосфора у 2 ml основног узорка и дељењем са 2 добија се садржај фосфора у mg/l. Множењем добијене вредности садржаја фосфора са 3,0665 добија се садржај фосфата PO42-.

7. ОДРЕЂИВАЊЕ САДРЖАЈА МЕТАНОЛА
(Табела 1, редни број 37, референца број 3)

Принцип методе:

Испитивана течност (вино), се најпре загревањем са алкалним раствором сребро нитрата ослободи алдехида и терпена. Потом метанол са калијум перманганатом бива оксидисан у киселој средини у формалдехид, који са хромотропном киселином и концентрованом сумпорном киселином даје обојење чији се интензитет мери.

Реагенси:

1) Калијум перманганат-фосфорна киселина:

– раствор A: 52,6667 g калијум перманганата p.a. раствори се у топлој дестилованој води и након хлађења допуни дестилованом водом до 1000 ml,

– раствор Б: око 200 g концентроване ортофосфорне киселине p.a. допуни се дестилованом водом до 1000 ml. 10 ml од овог раствора титрира се са 1N раствором NaOH уз индикатор фенолфталеин. Додавањем дестиловане воде или фосфорне киселине раствор се подешава тако да се за 10 ml раствора троши 30 ml 1N раствора NaOH,

– према потреби се 60 ml раствора A помеша тј. допуни до црте (100 ml) са раствором Б;

2) раствор оксал-сумпорне киселине: 15,75 g оксалне киселине p.a. и 25 ml концентроване сумпорне киселине растворити дестилованом водом и допунити до 250 ml;

3) раствор хромотропне киселине: 300 mg хромотропне киселине p.a. растворити у 20 ml дестиловане воде. Раствор се припремa непосредно пре употребе;

4) концентрована сумпорна киселина p.a. (најмање 81% m/m);

5) етанол ( 25% vol). Припрема се из етанола p.a;

6) 1N сребро нитрат (AgNO3);

7) 30 % калијум хидроксид (KOH).

Поступак:

Уколико се количина алкохола у вину означи са „а” у % vol, тада се 250/a ml из добијеног дестилата одмери у погодну тиквицу са шлифом и дестилованом водом допуни до 48 ml. Дода се 1,0 ml 1N AgNO3 и 0,5 ml раствора KOH (30%), неколико стаклених перли и стави на кључање 30 минута на повратном хладњаку. Након хлађења хладњак се одозго испира неколико пута са укупно 10 ml дестиловане воде, да би се спрали остаци алкохола у тиквици. Сада се ова тиквица са шлифом постави на апарат за дестилацију и садржај се лагано дестилује у нормални суд од 50 ml. Дестилат се на 20ºС допуни са дестилованом водом до 50 ml. Тако добијени дестилат садржи тачно 5% vol алкохола.

2,0 ml овог дестилата се у цилиндру за мешање са шлифом (ознаком на 10 ml) измеша са 5,0 ml раствора калијум перманганата у фосфорној киселини, уз повремено отварање цилиндра (епрувете) ради проветравања. Након стајања од 15 минута дода се 2,0 ml оксал-сумпорне киселине и брзо промућка. Услед јаког ослобађања угљен диоксида, одмах након мешања запушач се скида и овлаш постави. Након 15 минута раствор је потпуно безбојан и бистар. Уколико је још мала количина манган диоксида остала нерастворена, тада се цилиндар добро затвори и 2 до 3 пута садржај пажљиво измеша и запушач поново скида ради проветравања. Обезбојеном раствору се сада додаје 1,0 ml дестиловане воде, запушач чврсто постави и садржај више пута пажљиво промућка. Запушач се одмах скида ради проветравања од угљен диоксида. Уклањање угљен диоксида је потребно како би се количина раствора касније тачно одмерила. Сада се припрема раствор хромотропне киселине. 1,0 ml добијеног реакционог раствора се измеша у епрувети са шлифом са 1,0 ml хромотропне киселине. Кружно се промућка и лагано дода 10 ml концентроване сумпорне киселине. Постави се запушач и садржај пажљиво промућка напред-назад, пазећи да се не покваси запушач. Тада се поставља епрувета 20 минута у термостат на 60ºС и потом брзо охлади на 20ºС. Мерење екстинкције добијеног обојеног раствора врши се у киветама дебљине 10 mm према ваздуху на таласној дужини од 570 nm. Из екстинкције и калибрационе криве очитава се количина метанола у μg која се налази у примењених 0,2 ml за анализу.

Kонструисање калибрационе криве:

У тиквицу за одређивање јодног броја сипа се мало дестиловане воде и измери тачно на 4 децимале. Потом се дода 1,0 ml метанола и поново измери тачно, с тим што се претходно (након сипања метанола) врши кружно мешање метанола и воде и постављање запушача. Разлика у тежини нам даје тачну количину метанола. Раствор се тада квантитативно преноси у нормални суд од 1 литра и дестилованом водом допуни до црте. Потом се пипетира 5, 10, 15, 20 и 25 ml од овог основног раствора и након додатка 10 ml 25% vol етанола на 20ºC у нормалном суду од 50 ml допуни дестилованом водом до црте. По 2 ml раствора oвих стандардних раствора узима се за развијање боје и добијање калибрационе криве по већ описаном поступку. Ова крива се не завршава у нултој тачки кординатног система. На калибрационој криви нанете количине метанола у микрограмима садрже разблажење, уколико се у mg изражена одвага метанола подели са 100 и помножи са 2, 4, 6, 8 и 10. Једном слепом пробом (10 ml 25% етанола допунити дестилованом водом до црте у нормалном суду од 50 ml) могуће је уверити се да примењени етанол мерен према ваздуху не даје вишу екстинкцију од 0,08– 0,09.

Израчунавање:

У једном литру испитиване течности садржана количина метанола у милиграмима добија се множењем из калибрационе криве очитане вредности милиграма метанола са волумним процентима алкохола вина. Метанол се изражава у g/l на две децимале.

Прилог 3

СПЕЦИЈАЛНЕ И ПОСЕБНЕ МЕТОДЕ АНАЛИЗЕ РЕКТИФИКОВАНЕ КОНЦЕНТРОВАНЕ ШИРЕ

1. СПЕЦИЈАЛНЕ МЕТОДЕ АНАЛИЗЕ РЕКТИФИКОВАНЕ КОНЦЕНТРОВАНЕ ШИРЕ

a) АЛИЛ ИЗОТИОЦИЈАНАТИ

1) Принцип методе

Ако је алил изотиоцијанат присутан у вину, сакупити га дестилацијом и идентификовати гасном хроматографијом.

2) Реагенси

(2.1) Апсолутни етанол.

(2.2) Стандардни раствор: раствор алил изотиоцијаната у апсолутном алкохолу, који садржи 15 mg алил изотиоцијаната по литру.

(2.3) Мешавина за смрзавање коју чине етанол и суви лед (температура -60°C).

3) Апаратура

(3.1) Апаратура за дестилацију, како је приказана на слици 1 – Апаратура за дестилацију са протоком азота. Апаратуром непрекидно струји азот.

(3.2) Грејни плашт са термостатом.

(3.3) Мерач протока.

(3.4) Гасни хроматограф са детектором пламеног спектрофотометра, опремљен селективним филтером за једињења сумпора (таласна дужина = 394 nm), или било којим другим прикладним детектором.

(3.5) Хроматографска колона од нерђајућег челика унутрашњег пречника 3 mm и дужине 3 m, испуњена Carbowax-oм 20М при 10% на Chromosorb-у WHP, 80–100 меsh.

(3.6) Микрошприц, 10 μl.

4) Поступак

Ставити два литра вина у балон за дестилацију, додати неколико милилитара етанола (тачка 2) подтачка (2.1) овог пододељка) у две епрувете за прикупљање како би порозни делови штапића за распршивање гаса били потпуно уроњени. Охладити споља 2 епрувете помоћу мешавине за смрзавање. Спојити балон за дестилацију са епруветама за прикупљање и започети са испирањем апаратуре азотом уз проток од 3 литра на сат. Загрејати вино на 80°C помоћу грејног плашта, дестилисати и прикупити 45–50 ml дестилата.

Стабилизовати хроматограф. Препоручује се успостављање следећих услова:

– температура инјектора: 200°C;

– температура колоне: 130°C;

– брзина протока гаса носиоца хелијума: 20 ml/min.

Помоћу микрошприцa инјектовати количину стандардног раствора како би се на гасном хроматографy могao лако идентификовати пик који одговара алил изотиоцијанату. На сличан начин инјектовати аликвот дестилата у хроматограф. Проверити да ли ретенционо време добијеног пика одговара пику алил изотиоцијаната.

У горе описаним условима, једињења којa су природно присутна у вину не стварају интерферирајуће пикове на xроматограму раствора узорка.

Слика 1 – Апаратура за дестилацију са протоком азота

2. ПОСЕБНЕ МЕТОДЕ АНАЛИЗЕ ЗА РЕКТИФИКОВАНУ
КОНЦЕНТРОВАНУ ШИРУ

а) УКУПНИ КАТЈОНИ

1) Принцип

Третирати испитивани узорак јако киселим катјонским измењивачем. Катјони се смењују са H+. Укупни катјони изражавају се као разлика између укупних киселина елуата и испитиваног узорка.

2) Апаратура

(2.1) Стаклена колона унутрашњег пречника 10-11 mm и дужине око 300 mm са пипцима.

(2.2) pH метар са скалом калибрисаном у јединицама pH са тачношћу од барем 0,1 pH јединице.

(2.3) Електроде:

– Стаклена електрода, која се држи у дестилованој води;

– референтна каломел електрода (засићени калијум хлорид), која се држи у засићеном раствору калијум хлорида; или

– комбинована електрода, која се држи у дестилованој води.

3) Реагенси

(3.1) Јако кисела катjонска измењивачка смола у облику H+, која је током ноћи остављена у води како би набубрила.

(3.2) Раствор натријум хидроксида, 0,1 М.

(3.3) Папирни индикатор pH.

4) Поступак

(4.1) Припрема узорка

Користити pаствор који се добија разређивањем ректификоване концентроване шире на 40% (m/v): у нормални суд од 500 ml ставити тачно 200 g измерене ректификоване концентроване шире, допунити дестилованом водом до црте и хомогенизовати.

(4.2) Припрема јоноизмењивачке колоне

Улити у колону око 10 ml набубрелог јоно-измењивача у облику H+. Испрати колону дестилованом водом док се киселина у потпуности не уклони и користити папирни индикатор као помоћ при провери.

(4.3) Измена јона

Пропустити кроз колону 100 ml раствора ректификоване концентроване шире, припремљене у складу са подтачком (4.1) ове тачке, и то брзином од 1 капљице у секунди. Сакупити елуат у чашу. Испрати колону са 50 ml дестиловане воде. Титрирати киселину у елуату (укључно са водом за испирање) помоћу 0,1 М раствора натријум хидроксида док pH не буде 7, на температури од 20°C. Алкални раствор се додаје полако, па је раствор потребно непрекидно мућкати. Запремину 0,1 М употребљеног раствора натријум хидроксида означити са n ml.

5) Изражавање резултата

Укупни катјони се изражавају у милиеквивалентима по килограму (meq/l) укупног шећера до једног децималног броја.

(5.1) Прорачун

– Киселост елуата израженог у милиеквивалентима по килограму (meq/kg) ректификоване концентроване шире:

где је Е = слободни сумпор диоксид у милиграмима по литру износи 2,5 n.

– Укупне киселине ректификоване концентроване шире у милиеквивалентима по килограму: а.

– Укупни катјони у милиеквивалентима по килограму укупног шећера:

((2,5 n-a) / (P)) × 100

P = масена концентрација укупног шећера (% m/m).

б) ПРОВОДЉИВОСТ

1) Принцип

Електрична проводљивост колоне течности, што се одређује двeма упоредним електродама од платине на крајевима, мери се тако да се споји са 01:00 граном Wheatstone моста.

Проводљивост варира у зависности од температуре, па се зато изражава на температури од 20°C.

2) Апаратура

(2.1) Мерач проводљивости који омогућава мерење у распону 1-1000 микросименса на cm (μS cmˉ¹).

(2.2) Водено купатило са којим се температура узорака за анализу доводи на око 20°C (20 ± 2°C).

3) Реагенси

(3.1) Деминерализована вода одређене проводљивости мање од 2 μS cmˉ¹ при температури од 20°C.

(3.2) Референтни раствор калијум хлорида.

Растворити 0,581 g калијум хлорида (KCl), који је претходно био осушен до константне масе на температури од 105°C, у деминерализованој води (подтачка (3.1) ове тачке). Допунити деминерализованом водом (подтачка (3.1) ове тачке) до једног литра. Проводљивост овог раствора износи 1000 μS cmˉ¹ при температури од 20°C. Раствор се може користити најдуже до три месеца.

4) Поступак

(4.1) Припрема узорка за анализу

Користити раствор с укупном концентрацијом шећера од 25 % (m/m) (25°Brix): измерити количину једнаку 2500 / P и допунити деминерализованом водом до 100 g (тачка 3) подтачка (3.1) овог пододељка); где је P = проценат (m/m) концентрације укупног шећера у ректификованој концентрованој шири.

(4.2) Одређивање проводљивости

Узорак за анализу темперирати на воденом купатилу на температури од 20°C. Одржавати ту температуру уз одступање од ± 0,1°C. Испрати мерну ћелију два пута раствором који се испитује. Измерити проводљивост и исказати резултат у μS cmˉ¹.

5) Исказивање резултата

Резултат се исказује у микросименсима на cm (μS cmˉ¹) при температури од 20°C, заокружено на најближи цео број, за 25% (m/m) (25°Brix) раствор ректификоване концентроване шире.

(5.1) Израчунавање

Ако апаратура нема термостат, кориговати измерену проводљивост помоћу Табеле 1. Корективне вредности ако температура није 20°C (μS cmˉ¹). Ако је температура нижа од 20°C, додати корективну вредност; ако је температура виша од 20°C , одузети корективну вредност.

в) ХИДРОКСИМЕТИЛ ФУРФУРАЛ (HMF)

Принцип метода

1) Kолориметријска метода

Алдехиди добијени од фурана, од којих је најважнији хидроксиметил фурфурал, реагују са барбитурном киселином и p-толуидином, при чему настаје црвено једињење које се одређује колориметриjoм при 550 nm.

2) Течна хроматографија високе делотворности (HPLC)

Одвајање кроз колону помоћу хроматографије на реверзној фази и одређивање при 280 nm.

1) Kолориметријскa метода

(1.1) Апаратура

– Спектрофотометар за мерења између 300 и 700 nm;

– стаклене кивете са оптичким путем од 1 cm.

(1.2) Реагенси

– Барбитурна киселина, 0, 5% (m/v):

Pастворити 500 mg барбитурне киселине (C4O3N2H4) у дестилованој води и лагано загревати у воденом купатилу на температуру од 100°C. Допунити дестилованом водом до 100 ml. Раствор остаје стабилaн око недељу дана.

– Раствор p – толуидина, 10% (m/v):

Ставити 10g p – толуидина (C6 H4 (CH3) NH2) у нормални суд од 100 ml; додати 50 ml изопропанола CH3 CH (OH)CH3) и 10 ml ледене сирћетне киселине (CH3COOH) (ρ20 = 1,05 g / ml). Допунити изопропанолом до 100 ml. Овaj раствор je потребно поново припремaти из дана у дан.

– Етанал (ацеталдехид) (CH3CHO), 1% (m/v) водени раствор:

Припремити непосредно пре употребе.

– Хидроксиметил фурфурал (С6О3H6), 1g / l воденог раствора:

Припремити узастопно растворе који садрже 5, 10, 20, 30 и 40 mg /l. Раствор 1 g/ l и разблажени раствори морају бити свеже припремљени.

(1.3) Поступак

– Припрема узорка

Користити раствор који се добија разређивањем ректификоване концентроване шире на 40% (m/v): у нормални суд од 500 ml ставити тачно 200 g измерене ректификоване концентроване шире, долити дестиловану воду до црте и хомогенизовати. Извршити одређивање на 2 ml раствора.

– Колориметријско одређивање

У сваки од два нормална суда а и б од 25 ml са чепом од брушеног стакла улити 2 ml узорка припремљеног у складу са подтачком (1.3) алинеја прва ове тачке. У сваки суд улити 5 ml раствора p – толуидина (подтачка (1.2) алинеја друга ове тачке) и промешати. У суд б (контролни суд) додати 1 ml дестиловане воде, а у суд а 1 ml раствора барбитурне киселине (подтачка (1.2) алинеја прва ове тачке). Промућкати како би се течност хомогенизовала. Прелити садржаје судова у кивете спектрофотометра са оптичким путем од 1 cm. Поставити лествицу апсорбанције на нулу користећи садржај тиквице б при таласној дужини од 550 nm. Пратити промене апсорбанције садржаја суда а; забележити највећу вредност А, која се постиже након 2–5 минута.

Узорке са концентрацијама хидроксиметил фурфурала изнад 30 mg/l потребно је разредити пре анализе.

– Припрема калибрационе криве

Улити 2 ml сваког раствора хидроксиметил фурфурала са по 5, 10, 20, 30 и 40 mg/l (подтачка (1.2) алинеја четврта ове тачке) у два комплета суда од 25 ml а и б, те извршити на њима поступак из подтачке (1.3) алинеја трећа ове тачке.

Графички приказ, који приказује промену апсорбанције са концентрацијама хидроксиметил фурфурала у mg/l, чини равна линија која пролази кроз центар координатног система.

(1.4) Исказивање резултата

Концентрација хидроксиметил фурфурала у ректификованој концентрованој шири исказује се у милиграмима по килограму укупног шећера.

– Метода прорачуна

Концентрација хидроксиметил фурфурала C mg/l у анализираном узорку је концентрација на калибрационој криви која одговара апсорбанцији А измереној у узорку.

Концентрација хидроксиметил фурфурала у милиграмима по килограму укупног шећера рачуна се помоћу формуле:

250 × ((C) / (P))

P = проценат (m/m) концентрације укупног шећера у ректификованој концентрованој шири.

2) Течнa хроматографија високих перформанси

(2.1) Апаратура

– Течни хроматограф високих перформанси је опремљен:

инјектором („loop”), 5 или 10 μl; спектрофотометријским детектором за мерења при 280 nm; колоном од силицијума везаног са октадецилом (нпр. Bondapak C18 – Corasil, Waters Асс.); уређајем за снимање и према потреби интегратором.

Брзина протока мобилне фазе: 1,5 ml/min.

– Апаратура за мембранску филтрацију сa порама пречника 0,45 mm.

(2.2) Реагенси

– Двоструко дестилована вода;

– метанол (CH3OH), дестилован или HPLC чистоће;

– сирћетна киселина (CH3 COOH), (ρ20 = 1,05 g/ml);

– мобилна фаза: вода-метанол (подтачка (2.2) алинеја друга ове тачке) – Сирћетна киселина (подтачка (2.2) алинеја трећа ове тачке). Претходно филтрирана кроз мембрански филтер (0,45 μm), (40:9:1 v/v).

Ову мобилну фазу је потребно поново припремити из дана у дан и дегазирати пре употребе;

– референтни раствор хидроксиметил фурфурала, 25 mg/l (v/v):

Ставити 25 mg тачно измереног хидроксиметил фурфурала (C6H3О6) у нормални суд од 100 ml и допунити метанолом до ознаке (подтачка (2.2) алинеја друга ове тачке). Разредити овaj раствор 1/10 метанолом (подтачка (2.2) алинеја друга ове тачке) и филтрирати помоћу мембранског филтера (0,45 μm).

Ако се овај раствор чува у фрижидеру у херметички затвореним смеђим стакленим боцама, могуће га је чувати 2–3 месеца.

(2.3) Поступак

– Припрема узорка

Користити раствор који се добија разређивањем ректификоване концентроване шире на 40% (m/v) (у нормални суд од 500 ml ставити тачно 200 g измерене ректификоване концентроване шире). Допунити дестилованом водом до црте и хомогенизовати, затим филтрирати помоћу мембранског филтера (0,45 μm).

– Хроматографско одређивање

Убризгати 5 или 10 μl узорка припремљеног у складу са подтачком (2.3) алинеја прва ове тачке и 5 или 10 μl референтног раствора хидроксиметил фурфурала (подтачка (2.2) алинеја пета ове тачке) у хроматограф. Забележити хроматограм.

Време задржавања хидроксиметил фурфурала износи приближно 6–7 минута.

(2.4) Исказивање резултата

Концентрација хидроксиметил фурфурала у ректификованој концентрованој шири изражава се у милиграмима по килограму укупног шећера.

– Метода прорачуна

Концентрацију хидроксиметил фурфурала у 40% (m/v) раствору ректификоване концентроване шире означити са C mg / l.

Концентрација хидроксиметил фурфурала у милиграмима по килограму укупног шећера рачуна се помоћу формуле:

250 × ((C) / (P)),

где је P = проценат (m/m) концентрације укупног шећера у ректификованој концентрованој шири.

г) ТЕШКИ МЕТАЛИ

Принцип

1) Брза метода за анализу тешких метала

Тешки метали се у примерено разређеноj ректификованој концентрованој шири откривају захваљујући боји коју узрокује стварање сулфида. Они се оцењују поређењем са стандардним раствором олова која одговара највећој прихватљивој концентрацији.

2) Одређивање садржаја олова атомском апсорпционом спектрофотометријом

Хелат, који настаје везивањем олова са амонијум пиролидин дитиокарбаматом, екстраховати са метил изобутил кетоном и измерити апсорбцију при 283,3 nm. Садржај олова одређује се уз помоћ познатих додатних количина олова у низу референтних раствора.

1) Брза метода за анализу тешких метала

(1.1) Реагенси

– Рaзрeђeна хлороводнична киселина, 70% (m/v):

Узети 70g хлороводоничне киселине (HCl) (ρ20 = 1,16-1,19 g/ml) и допунити дестилованом водом до 100 ml.

– Рaзрeђeна хлороводнична киселина 20% (m/v):

Узети 20 g хлороводоничне киселине (HCl) (ρ20= 1,16-1,19 g/ml) и допунити дестилованом водом до 100 ml.

– Разређени амонијак:

Узети 14 g амонијака (NH3) (ρ20 = 0,931–0,934 g/ml) и допунити дестилованом водом до 100 ml.

– Пуферски раствор pH 3,5:

Растворити 25g амонијум ацетата (CH3COONH4) у 25 ml воде и додати 38 ml разблажене хлороводоничне киселине (подтачка (1.1) алинеја прва ове тачке). Према потреби прилагодити pH помоћу разређене хлороводоничне киселине (подтачка (1.1) алинеја друга ове тачке) или разређеног амонијака (подтачка (1.1) алинеја трећа ове тачке), те допунити дестилованом водом до 100 ml.

– Раствор тиоацетамида (C2H5NS), 4% (m/v).

– Раствор глицерола (C3H8О3), 85% (m/v)

(n D20°C= 1,449–1,455).

– Реагенс тиоацетамида:

У 0,2 ml раствора тиоацетамида (подтачка (1.1) алинеја пета ове тачке) додати 1 ml мешавине коју чини 5 ml воде, 15 ml 1 М раствора натријум хидроксида и 20 ml глицерола (подтачка (1.1) алинеја шеста ове тачке). Грејати 20 секунди у воденом купатилу на температури од 100°C. Припремити непосредно пре употребе.

– Раствор који садржи 0,002g/l олова:

Припремити раствор 1 g/l олова растварањем 0,400 g олово нитрата (Pb(NО3) 2) у води и додавањем дестиловане воде до 250 ml. Приликом употребе разредити овaj раствор са два дела воде у 1000 (v/v) како би се добио раствор од 0,002 g/l.

(1.2) Поступак

Растворити испитивани узорак од 10 g ректификоване концентроване шире у 10 ml воде. Додати 2 ml пуферског раствора pH 3,5 (подтачка (1.1) алинеја четврта ове тачке) и помешати. Додати 1,2 ml реагенса тиоацетамида (подтачка (1.1) алинеја седма ове тачке) и одмах помешати. Припремити контролни узорак у истим условима помоћу 10 ml раствора олова од 0,002 g/l (подтачка (1.1) алинеја осма ове тачке).

Након два минута, смеђа боја ректификоване концентроване шире не би требало да буде интензивнија у односу на боју контролног узорка.

(1.3) Прорачун

У условима горе описаног поступка контролни узорак одговара највећој прихватљивој концентрацији тешких метала израженој као 2 mg/kg олова у ректификованој концентрованој шири.

2) Одређивање садржаја олова атомском апсорпционом спектрофотометријом

(2.1) Апаратура

– Атомски апсорпциони спектрофотометар опремљен гориоником ваздух-ацетилен;

– шупља оловна катодна цев.

(2.2) Реагенси

– Разређена сирћетна киселина:

Узети 12 ml ледене сирћетне киселине (ρ20 = 1,05 g/ml) и допунити дестилованом водом до 100 ml.

– Раствор амонијум пиролидин дитиокарбамата (C5H12N2S2), 1% (m/v).

– Метил изобутил кетон, (CH3)2CHCH2COCH3.

– Раствор који садржи 0,010 g/l олова:

Разредити 1 g/l раствора олова (подтачка (1.1) алинеја осма ове тачке) На 1% (v/v).

(2.3) Поступак

– Припрема раствора за анализу

Растворити 10 g ректификоване концентроване шире у мешавини разређене сирћетне киселине (подтачка (2.2) алинеја прва ове тачке) и воде у једнаким запреминама и допунити овом мешавином до 100 ml.

Додати 2 ml раствора амонијум пиролидин дитиокарбамата (подтачка (2.2) алинеја друга ове тачке) и 10 ml метил изобутил кетона (подтачка (2.2) алинеја трећа ове тачке). Протрести 30 секунди не излажући течност јарком светлу. Оставити да се два слоја раздвоје. Употребити слој метил изобутил кетона.

– Припрема референтних раствора

Припремити 3 референтна раствора којa уз 10 g ректификоване концентроване шире садрже 1,2 односно 3 ml раствора са 0,010 g/l олова (подтачка (2.2) алинеја четврта ове тачке). Поступити сa тим раствором на једнак начин као и са раствором за анализу.

– Контролни узорак

Припремити контролни узорак у истим условима како је описано у подтачки (2.3) алинеја прва ове тачке, али без додавања ректификоване концентроване шире.

– Одређивање

Поставити таласну дужину на 283,3 nm. Распршити метил изобутил кетон из контролног узорка у пламену и поставити лествицу апсорбанције на нулу. Користећи екстракте одговарајућих раствора одредити апсорбцију раствора за анализу и референтних раствора.

(2.4) Исказивање резултата

Садржај олова исказује се у милиграмима по килограму ректификоване концентроване шире, заокружено на једну децималу.

– Прорачун

Конструисати калибрациону криву из које је видљива промена апсорбанције у функцији концентрације олова додатог референтним растворима, с тиме да концентрација једнака нули одговара раствору за анализу.

Екстраполирати равну црту која повезује тачке док не пресече негативни део осе концентрације. Удаљеност тачке пресека од центра координатног система јесте концентрација олова у анализираном раствору.

д) ОДРЕЂИВАЊЕ ЕТАНОЛА

Ова метода се користи за одређивање алкохолне јачине у течностима са ниским садржајем алкохола, као што су шире, концентроване шире и ректификоване концентроване шире.

1) Принцип

Једноставна дестилација течности.

Оксидација етанола у дестилату помоћу калијум дихромата. Титрација вишка дихромата раствором гвожђа (II).

2) Апаратура

(2.1) Апаратура за дестилацију која се користи за мерење јачине алкохола.

3) Реагенси

(3.1) Раствор калијум дихромата:

Растворити 33,600 g калијум дихромата (К2Cr2О7) у довољној количини воде како би се при 20°C добио 1 литар раствора. Један милилитар овoг раствора оксидира 7,8924 mg алкохола.

(3.2) Раствор гвожђе (II) амонијум сулфата:

Растворити 135 g гвожђе (II) амонијум сулфата (FeSО4(NH4)2SО4 × 6H2О у довољној количини воде како би се добио 1 литар раствора и додати 20 ml концентроване сумпорне киселине (H2 SО4), (ρ 20 = 1,84 g/ml). Овај раствор више-мање одговара половини запремине тек припремљеног раствора дихромата. Накнадно, она полако оксидира.

(3.3) Раствор калијум перманганата:

Растворити 1,088 g калијум перманганата (КМnО4) у довољној количини воде како би се добио 1 литар раствора.

(3.4) Сумпорна киселина, разређена у односу 1:2 (v/v):

Непрекидно мешајући, постепено додавати 500 ml сумпорне киселине (H2SО4) (ρ 20 = 1,84 g/ml) у 500 ml воде.

(3.5) Реагенс гвожђе ортофенантролин:

Растворити 0,695 g сулфата гвожђа (FeSO4 × 7H2О) у 100 ml воде и додати 1,485 ортофенантролин монохидрата (C12H8N2 × H2О). Загревати како би се поспешило растварање. Настала јарко црвена боја раствора је стабилна.

4) Поступак

(4.1) Дестилација

Ставити 100 g ректификоване концентроване шире и 100 ml воде у балон за дестилацију. Сакупити дестилат у нормални суд од 100 ml и допунити водом до црте.

(4.2) Оксидација

Узети суд од 300 ml са чепом од брушеног стакла и проширеним грлом који је могуће испрати без губитака. Ставити у суд 20 ml титрационог раствора калијум дихромата (тачка 3) подтачка (3.1) овог пододељка) и 20 ml разблажене сумпорне киселине у размери 1:2 (v/v) (тачка 3) подтачка (3.4) овог пододељка), и промућкати. Додати 20 ml дестилата, затворити суд, промућкати и причекати барем 30 минута повремено мућкајући суд. (Ово је нормални суд.)

Извршити титрацију гвожђе (II) амонијум сулфата (тачка 3) подтачка (3.2) овог пододељка) у односу на раствор калијум дихромата тако да се у једнаке судове ставе исте количине реагенаса, с тиме да је 20 ml дестилата потребно заменити са 20 ml дестиловане воде. (Ово је контролни суд.)

(4.3) Титрација

У садржај нормалног суда додати 4 капљице реагенса ортофенантролина (тачка 3) подтачка (3.5) овог пододељка). Титрирати вишак дихромата додавањем раствора гвожђе (II) амонијум сулфата (тачка 3) подтачка (3.2) овог пододељка). Престати са додавањем раствора гвожђа када се боја раствора промени из зелено-плаве у смеђу.

Како би се тачније могао одредити крај, поново променити боју мешавине из смеђе у зелено-плаву помоћу раствора калијум перманганата (тачка 3) подтачка (3.3) овог пододељка). Одузети десетину запремине овог раствора од запремине додатог раствора гвожђа (II). Означити разлику са n ml.

Извршити исти поступак на исти начин са контролним судом. Означити разлику са n‘ ml.

5) Исказивање резултата

Етанол се изражава у грамима по килограму (g/kg) укупног шећера и заокружује се на једну децималну цифру.

(5.1) Метода прорачуна

n‘ ml раствора гвожђа редукује 20 ml раствора дихромата, који оксидира 157,85 mg чистог етанола.

Један милилитар раствора гвожђа (II) има једнаку снагу као редукциони:

((157,85) / (n)) mg етанола.

n-n‘ раствора гвожђа (II) има једнаку снагу као редукциони:

157,85 × ((n‘ - n) / (n)) mg етанола.

Концентрација етанола у g/kg ректификоване концентроване шире добија се помоћу следеће формуле:

7,892 × ((n‘ - n) / (n))

Концентрација етанола у g/kg укупног шећера добија се помоћу следеће формуле:

789,2 × ((n‘ - n) / (n‘ × P)),

где је P = % (m/m) концентрације укупног шећера у ректификованој концентрованој шири.

ђ) МЕЗО-ИНОЗИТОЛ, СЦИЛO-ИНОЗИТОЛ И САХАРОЗА

1) Принцип

Гасна хроматографија силилованих деривата.

2) Реагенси

(2.1) Интерни стандард: ксилитол (водени раствор од око 10 g/l коме је потребно додати натријум азид на врху шпатуле).

(2.2) Bis (Триметилсилил) трифлуороацетамид - BSTFA - (С8H18F3NOSi2).

(2.3) Триметил хлорсилан (C5 H9 ClSi).

(2.4) Пиридин p.а. (C5 H5 N20).

(2.5) Мезо-инозитол (С6H12О6).

3) Апаратура

(3.1) Гасни хроматограф опремљен:

(3.2) Капиларном колоном (нпр. од таљеног силицијум диоксида, пресвучена са ОВ 1, дебљине филма 0,15 μm, дужине 25m и унутрашњег пречника 0,3 mm).

Радни услови:

– гас носилац – водоник или хелијум;

– брзина протока гаса носиоца: око 2 ml/минути;

– температура инјектора и детектора: 300°C;

– програмирање температуре: 1 минут на 160°C, пораст од 4°C у минути до 260°C, константна температура од 260°С током 15 минута;

– однос: око 1:20.

(3.3) Интегратор.

(3.4) Микрошприц, 10 μl.

(3.5) Микропипете од 50, 100 и 200 μl.

(3.6) Судови од 2 ml са тефлонским чепом.

(3.7) Пећ.

4) Поступак

Тачно измерени узорак од око 5 g ректификоване концентроване шире ставити у нормални суд од 50 ml. Додати 1 ml стандардног раствора ксилитола (тачка 2) подтачка (2.1) овог пододељка) и допунити водом до врха. Промешати и након тога узети 100 μl раствора и улити у суд (тачка 3) подтачка (3.6) овог пододељка) и испарити лаганим струјањем ваздуха. Према потреби је могуће додати 100 μl апсолутног етил алкохола како би се убрзало испаравање.

Пажљиво растворити остатак у 100 μl пиридина (тачка 2) подтачка (2.4) овог пододељка) и 100 μl Бис (Триметилсилил) трифлуороацетамида (тачка 2) подтачка (2.2) овог пододељка), додати 10 μl триметил хлорсилана (тачка 2) подтачка (2.3) овог пододељка). Затворити суд тефлонским чепом и грејати на 60°C сат времена.

Растворити 0,5 μl бистре течности и убризгати помоћу загрејане шупље игле у складу са наведеним сплитом.

5) Израчунавање резултата

(5.1) Припремити раствор који садржи:

60 g/l глукозе, 60 g/l фруктозе, 1 g/l мезо-инозитола и 1 g/l сахарозе.

Измерити 5 g раствора и извршити поступак у складу са тачком 4) овог пододељка Резултати за мезо-инозитол и сахарозу у односу на ксилитол рачунају се из хроматограма.

У случају сцило-инозитола, који није доступан на тржишту и чије је време задржавања између последњег пика аномерног облика глукозе и пика мезо-инозитола (видети графички приказ), узима се исти резултат као за мезо-инозитол.

6) Исказивање резултата

(6.1) Мезо-инозитол и сцило-инозитол исказују се у милиграмима по килограму укупног шећера. Сахароза се изражава по килограму шире.